本文關(guān)鍵詞：TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：由同源盒基因Nkx6.2編碼產(chǎn)生的同源結(jié)構(gòu)域Nkx6.2作為一種反式作用因子,在少突膠質(zhì)細(xì)胞特化、成熟及髓鞘形成過程中和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)胚胎期神經(jīng)母細(xì)胞特化生,都發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究過程中發(fā)現(xiàn),腦發(fā)育時(shí)期甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)不足會(huì)造成CNS內(nèi)重要神經(jīng)細(xì)胞異常,同時(shí)伴隨Nkx6.2低表達(dá)。但是,由于TH不足導(dǎo)致的腦發(fā)育遲滯的病理過程中,轉(zhuǎn)錄因子Nkx6.2參與的具體機(jī)制尚不明確。我們希望通過給予甲狀腺功能減低模型添加外源性Nkx6.2的方法,可以有助于解決或部分解決這一問題。 本課題組前期工作將Nkx6.2與核定位信號(hào)(nuclear location sequence, NLS)、TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain, PTD)一起構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TN-NKx6.2。本文將該重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TN-NKx6.2轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞并表達(dá),細(xì)胞熒光免疫確定其表達(dá)產(chǎn)物可以進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核。之后對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的純化TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白,進(jìn)行熒光染料Cy7-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Cy7-N-hydroxysuccinimide ester, Cy7NHS)的標(biāo)記。隨后向小鼠尾靜脈注射Cy7-TN-Nkx6.2,應(yīng)用活體熒光成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)融合蛋白TN-Nkx6.2在小鼠腦部的動(dòng)態(tài)分布,結(jié)果證明該融合蛋白能夠通過血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)進(jìn)而到達(dá)腦組織；同時(shí)通過免疫熒光組化實(shí)驗(yàn)表明該融合蛋白可以內(nèi)化進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞胞漿、胞核。最后向神經(jīng)干細(xì)胞中加入融合蛋白TN-Nkx6.2繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞熒光免疫反應(yīng)觀察不同培養(yǎng)不同時(shí)間段神經(jīng)細(xì)胞分化情況,發(fā)現(xiàn)融合蛋白TN-Nkx6.2可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化,尤其是促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞特化,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的成熟。
【關(guān)鍵詞】：同源盒基因Nkx6.2 pET-28a質(zhì)粒 TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白 活體熒光成像 神經(jīng)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411;Q78
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• ~.略語/符號(hào)說明9-11
• 前言11-15
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、TN-Nkx6.2 基因在神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)15-23
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象15-17
• 1.1.1 菌株、載體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15-16
• 1.1.2 工具酶及分子量標(biāo)志物16
• 1.1.3 主要化學(xué)試劑16
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器16-17
• 1.1.5 培養(yǎng)液17
• 1.2 試驗(yàn)方法17-19
• 1.2.1 分離并培養(yǎng)大鼠神經(jīng)細(xì)胞17-18
• 1.2.2 pET-28a-TN-Nkx6.2轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞18-19
• 1.2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)pET-28a-TN-Nkx6.2在神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-21
• 1.3.1 pET-28a-TN-Nkx6.2鑒定19
• 1.3.2 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)pET-28a-TN-Nkx6.2在神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)19-21
• 1.4 討論21-22
• 1.4.1 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)21
• 1.4.2 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)21
• 1.4.3 陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染21-22
• 1.5 小結(jié)22-23
• 二、TN-Nkx6.2 融合蛋白在小鼠腦中分布的鑒定23-33
• 2.1 對(duì)象和方法23-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 2.1.2 主要試劑及試劑盒23-24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-27
• 2.2.1 Cy7 NHS標(biāo)記融合蛋白TN-Nkx6.224-25
• 2.2.2 標(biāo)記效率F/P值計(jì)算25
• 2.2.3 活體熒光成像系統(tǒng)分析TN-Nkx6.2在小鼠腦內(nèi)分布25
• 2.2.4 免疫熒光組化觀察TN-Nkx6.2在小鼠腦組織分布情況25-26
• 2.2.5 TUNEL試劑盒染色26
• 2.2.6 觀察指標(biāo)和統(tǒng)計(jì)方法26-27
• 2.3 結(jié)果27-30
• 2.3.1 Cy7-TN-Nkx6.2融合蛋白在腦中的動(dòng)態(tài)分布27-29
• 2.3.2 熒光免疫組化染色觀察TN-Nkx6.2在小鼠腦組織分布29
• 2.3.3 各組小鼠大腦皮層細(xì)胞凋亡指數(shù)比較29-30
• 2.4 討論30-32
• 2.4.1 熒光成像技術(shù)及在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用30-31
• 2.4.2 KODAK活體動(dòng)物成像系統(tǒng)31-32
• 2.5 小結(jié)32-33
• 三、融合蛋白TN-Nkx6.2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響33-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象33-34
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 3.1.2 主要儀器33
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑33
• 3.1.4 部分試劑的配制33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 3.2.1 提取并培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞34-35
• 3.2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)分化情況35-36
• 3.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法36
• 3.3 結(jié)果36-41
• 3.3.1 神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)36
• 3.3.2 神經(jīng)干細(xì)胞分化鑒定36-38
• 3.3.3 Nkx-6.2蛋白對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響38-41
• 3.4 討論41-42
• 3.5 小結(jié)42-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明48-49
• 附錄49-54
• 綜述 同源盒基因Nkxs對(duì)低典大鼠甲低影響的研究進(jìn)展54-64
• 綜述參考文獻(xiàn)58-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 季麗莉;佟雷;王振宇;;神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和體外培養(yǎng)鑒定[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2007年02期

2 李榕;伍思霖;王霞;王凱;茍興春;;TAT蛋白及其轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究中的應(yīng)用[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2011年04期

3 支德福;王冰;崔韶輝;楊寶靈;趙不凋;趙軼男;姜云霞;于世鈞;張樹彪;;兩種陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的比較研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2009年05期

4 梁東春,吳伊麗,郭剛,趙學(xué)勤,張鏡宇;碘缺乏對(duì)大鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子1基因表達(dá)的影響[J];中國(guó)地方病學(xué)雜志;2003年01期

5 朱淼鑫;姚明;;小動(dòng)物活體成像技術(shù)的應(yīng)用[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2011年03期

6 蘇青,羅敏,陳源,劉紅標(biāo),陸志強(qiáng),陳家倫;甲狀腺激素缺乏對(duì)發(fā)育期鼠腦蛋白激酶C活性的影響[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2000年02期

  本文關(guān)鍵詞：TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：446530