本文關鍵詞：致倦庫蚊Chymotrypsin-like蛋白與有機磷抗性關系的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蚊蟲可以傳播多種疾病，如西尼羅河病、瘧疾、絲蟲病、登革熱、乙型腦炎等，對人類健康構成嚴重威脅。蚊蟲的主要防治是化學防治，然而有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的長期、廣泛的使用，已引起蚊蟲的抗藥性。蚊蟲抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，成為蚊蟲防治的一個重大障礙。探究抗性分子機制有利于新型殺蟲劑的研發(fā)。 本研究組前期采用抑制性差減雜交、構建差減文庫及斑點雜交，，發(fā)現(xiàn)一個Chymotrypsin（CHY）基因在致倦庫蚊Culex pipiens quinquefasciatus對硫磷抗性品系中高表達。用BliastX軟件在NCBI上進行比對，發(fā)現(xiàn)高表達的CHY與XM_001843342具有98.58%同源性。在此基礎上，利用PCR技術擴增出CHY884bp片段，開放閱讀框為849bp，預測編碼282個氨基酸，大小為30.6KD。SignalP3.0分析在其C端有一個16aa的分泌信號肽。CHY家族有三個保守的活性位點His89、Asp138、Ser230，而本研究克隆的CHY只有一個活性位點Asp138，而另外兩個活性位點已突變?yōu)锳sn89和Arg230。 將CHY與pET28a載體連接，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達，發(fā)現(xiàn)CHY在細胞裂解的沉淀中。用尿素提取純化CHY后制備了多克隆抗體。將CHY與pFastbac載體連接，轉染昆蟲sf9細胞并表達，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)CHY位于細胞裂解沉淀中。以苯甲酰-酪氨酸乙酯（BTEE）為底物，沒有檢測到原核表達或真核表達細胞沉淀中CHY的活性。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)CHY蛋白在致倦庫蚊體內(nèi)為膜蛋白。 利用siRNA干擾致倦庫蚊細胞中CHY的表達，經(jīng)過實時定量PCR驗證，干擾效率為76.86%。在無任何農(nóng)藥時，干擾組細胞存活率與對照組相比沒有差異；在對硫磷濃度15ppm、對氧磷濃度3.5ppm和5ppm、久效磷的濃度20ppm時，干擾組細胞存活率分別比對照組降低9.90%、6.96%、15.83%、20.04%(p0.05)，說明CHY與致倦庫蚊對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性相關。 通過去除一個致倦庫蚊野生種群的乙酰膽堿酯酶G119S突變引起的靶標抗性、篩選低活性的羧酸酯酶、P450單加氧酶和谷胱甘肽-S-轉移酶，建立了一個對殺蟲劑敏感的致倦庫蚊品系。該品系的羧酸酯酶活性是敏感品系S-lab的2.5倍，P450和GST的活性與S-lab相當。生物測定表明，與S-lab相比，該品系對有機磷殺蟲劑有低于2倍的抗性，對氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑沒有抗性，可以作為敏感標準品系用于抗性監(jiān)測。
【關鍵詞】：致倦庫蚊 抗藥性 Chymotrypsin 體外表達 siRNA干擾
【學位授予單位】：曲阜師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R384.1
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 引言8-13
• 1. 蚊蟲與相關傳染病8
• 2. 蚊蟲防治和抗性8-10
• 2.1 蚊蟲防治8
• 2.2 蚊蟲抗性水平8-9
• 2.3 蚊蟲抗性機制9-10
• 3. CHY 研究進展10-12
• 3.1 CHY 合成和激活10
• 3.2 CHY 生化性質10-11
• 3.3 功能研究11-12
• 3.4 展望12
• 4. 論文研究的背景和意義12-13
• 第一章 致倦庫蚊 CHY 基因克隆與鑒定13-19
• 1、材料和方法13-14
• 1.1 材料13
• 1.2 方法13-14
• 2、結果與分析14-18
• 2.1 PCR 產(chǎn)物14
• 2.2 菌落 PCR 鑒定14-15
• 2.3 致倦庫蚊 CHY 序列分析15-16
• 2.4 進化樹分析16-18
• 3、本章小結18-19
• 第二章 CHY 基因體外表達19-29
• 1、材料和方法19-25
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-25
• 2、結果與分析25-28
• 2.1 PCR 產(chǎn)物25-26
• 2.2 pMD18-T/CHY1、pMD18-T/CHY2 質粒鑒定26
• 2.3 pET28a/CHY、pFastBac/CHY 陽性克隆鑒定26-27
• 2.4 融合蛋白在 BL21 中的表達27
• 2.5 抗體檢測及 sf9 表達蛋白鑒定結果27-28
• 2.6 融合蛋白酶活鑒定28
• 3、本章小結28-29
• 第三章 CHY 低表達對蚊細胞殺蟲劑抗性的影響29-37
• 1、材料與方法29-33
• 1.1 材料29
• 1.2 方法29-33
• 2、結果與討論33-36
• 2.1 Negative control FAM 轉染效率33-34
• 2.2 siRNA 干擾效率34-35
• 2.3 siRNA 干擾后蚊細胞增長的變化35
• 2.4 siRNA 干擾 CHY 后蚊細胞對殺蟲劑抗性的變化35-36
• 3、本章小結36-37
• 第四章 一個致倦庫蚊殺蟲劑敏感品系的篩選37-41
• 1、材料和方法37-38
• 1.1 材料37
• 1.2 方法37-38
• 2、結果與分析38-40
• 2.1 篩選無乙酰膽堿酯酶靶標抗性的單雌系38
• 2.2 單雌系羧酸酯酶、GST、P450 酶活性38-39
• 2.3 4 號單雌系的羧酸酯酶多態(tài)性39
• 2.4 4 號單雌系的抗性水平39-40
• 3、本章小結40-41
• 全文總結和展望41-42
• 參考文獻42-48
• 期間的研究成果及發(fā)表的學術論文48-49
• 致謝49

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 華小梅,江希流;我國農(nóng)藥的生產(chǎn)使用狀況及其對環(huán)境的影響[J];環(huán)境保護;1999年09期

2 喬傳令,J.Hemingway,李tD;有機磷抗性致倦庫蚊種群中酯酶基因擴增的定量分析[J];昆蟲學報;2003年01期

3 王琛柱，欽俊德;棉鈴蟲幼蟲中腸主要蛋白酶活性的鑒定[J];昆蟲學報;1996年01期

4 崔峰;喬傳令;;蚊蟲抗藥性分子機理[J];昆蟲知識;2007年05期

5 劉劍;;中國農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)市場結構研究[J];科協(xié)論壇(下半月);2009年06期

6 丁俊;;瘧疾流行現(xiàn)狀研究進展[J];中國公共衛(wèi)生;2012年05期

7 劉斯璐;崔峰;燕帥國;喬傳令;;中國媒介蚊蟲對有機氯類和氨基甲酸酯類殺蟲劑的抗性調(diào)查[J];中國媒介生物學及控制雜志;2011年01期

8 常海靜;劉洋洋;江紅;喬傳令;盧希平;郎明林;崔峰;;酯酶顯色法快速檢測尖音庫蚊對有機磷的抗性[J];中國媒介生物學及控制雜志;2011年04期

  本文關鍵詞：致倦庫蚊Chymotrypsin-like蛋白與有機磷抗性關系的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：445453