本文關(guān)鍵詞：致倦庫(kù)蚊Chymotrypsin-like蛋白與有機(jī)磷抗性關(guān)系的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蚊蟲(chóng)可以傳播多種疾病，如西尼羅河病、瘧疾、絲蟲(chóng)病、登革熱、乙型腦炎等，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。蚊蟲(chóng)的主要防治是化學(xué)防治，然而有機(jī)磷類(lèi)、有機(jī)氯類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的長(zhǎng)期、廣泛的使用，已引起蚊蟲(chóng)的抗藥性。蚊蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，成為蚊蟲(chóng)防治的一個(gè)重大障礙。探究抗性分子機(jī)制有利于新型殺蟲(chóng)劑的研發(fā)。 本研究組前期采用抑制性差減雜交、構(gòu)建差減文庫(kù)及斑點(diǎn)雜交，，發(fā)現(xiàn)一個(gè)Chymotrypsin（CHY）基因在致倦庫(kù)蚊Culex pipiens quinquefasciatus對(duì)硫磷抗性品系中高表達(dá)。用BliastX軟件在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的CHY與XM_001843342具有98.58%同源性。在此基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出CHY884bp片段，開(kāi)放閱讀框?yàn)?49bp，預(yù)測(cè)編碼282個(gè)氨基酸，大小為30.6KD。SignalP3.0分析在其C端有一個(gè)16aa的分泌信號(hào)肽。CHY家族有三個(gè)保守的活性位點(diǎn)His89、Asp138、Ser230，而本研究克隆的CHY只有一個(gè)活性位點(diǎn)Asp138，而另外兩個(gè)活性位點(diǎn)已突變?yōu)锳sn89和Arg230。 將CHY與pET28a載體連接，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CHY在細(xì)胞裂解的沉淀中。用尿素提取純化CHY后制備了多克隆抗體。將CHY與pFastbac載體連接，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)sf9細(xì)胞并表達(dá)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CHY位于細(xì)胞裂解沉淀中。以苯甲酰-酪氨酸乙酯（BTEE）為底物，沒(méi)有檢測(cè)到原核表達(dá)或真核表達(dá)細(xì)胞沉淀中CHY的活性。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CHY蛋白在致倦庫(kù)蚊體內(nèi)為膜蛋白。 利用siRNA干擾致倦庫(kù)蚊細(xì)胞中CHY的表達(dá)，經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，干擾效率為76.86%。在無(wú)任何農(nóng)藥時(shí)，干擾組細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比沒(méi)有差異；在對(duì)硫磷濃度15ppm、對(duì)氧磷濃度3.5ppm和5ppm、久效磷的濃度20ppm時(shí)，干擾組細(xì)胞存活率分別比對(duì)照組降低9.90%、6.96%、15.83%、20.04%(p0.05)，說(shuō)明CHY與致倦庫(kù)蚊對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性相關(guān)。 通過(guò)去除一個(gè)致倦庫(kù)蚊野生種群的乙酰膽堿酯酶G119S突變引起的靶標(biāo)抗性、篩選低活性的羧酸酯酶、P450單加氧酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，建立了一個(gè)對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感的致倦庫(kù)蚊品系。該品系的羧酸酯酶活性是敏感品系S-lab的2.5倍，P450和GST的活性與S-lab相當(dāng)。生物測(cè)定表明，與S-lab相比，該品系對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑有低于2倍的抗性，對(duì)氨基甲酸酯和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑沒(méi)有抗性，可以作為敏感標(biāo)準(zhǔn)品系用于抗性監(jiān)測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：致倦庫(kù)蚊 抗藥性 Chymotrypsin 體外表達(dá) siRNA干擾
【學(xué)位授予單位】：曲阜師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R384.1
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 引言8-13
• 1. 蚊蟲(chóng)與相關(guān)傳染病8
• 2. 蚊蟲(chóng)防治和抗性8-10
• 2.1 蚊蟲(chóng)防治8
• 2.2 蚊蟲(chóng)抗性水平8-9
• 2.3 蚊蟲(chóng)抗性機(jī)制9-10
• 3. CHY 研究進(jìn)展10-12
• 3.1 CHY 合成和激活10
• 3.2 CHY 生化性質(zhì)10-11
• 3.3 功能研究11-12
• 3.4 展望12
• 4. 論文研究的背景和意義12-13
• 第一章 致倦庫(kù)蚊 CHY 基因克隆與鑒定13-19
• 1、材料和方法13-14
• 1.1 材料13
• 1.2 方法13-14
• 2、結(jié)果與分析14-18
• 2.1 PCR 產(chǎn)物14
• 2.2 菌落 PCR 鑒定14-15
• 2.3 致倦庫(kù)蚊 CHY 序列分析15-16
• 2.4 進(jìn)化樹(shù)分析16-18
• 3、本章小結(jié)18-19
• 第二章 CHY 基因體外表達(dá)19-29
• 1、材料和方法19-25
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-25
• 2、結(jié)果與分析25-28
• 2.1 PCR 產(chǎn)物25-26
• 2.2 pMD18-T/CHY1、pMD18-T/CHY2 質(zhì)粒鑒定26
• 2.3 pET28a/CHY、pFastBac/CHY 陽(yáng)性克隆鑒定26-27
• 2.4 融合蛋白在 BL21 中的表達(dá)27
• 2.5 抗體檢測(cè)及 sf9 表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果27-28
• 2.6 融合蛋白酶活鑒定28
• 3、本章小結(jié)28-29
• 第三章 CHY 低表達(dá)對(duì)蚊細(xì)胞殺蟲(chóng)劑抗性的影響29-37
• 1、材料與方法29-33
• 1.1 材料29
• 1.2 方法29-33
• 2、結(jié)果與討論33-36
• 2.1 Negative control FAM 轉(zhuǎn)染效率33-34
• 2.2 siRNA 干擾效率34-35
• 2.3 siRNA 干擾后蚊細(xì)胞增長(zhǎng)的變化35
• 2.4 siRNA 干擾 CHY 后蚊細(xì)胞對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性的變化35-36
• 3、本章小結(jié)36-37
• 第四章 一個(gè)致倦庫(kù)蚊殺蟲(chóng)劑敏感品系的篩選37-41
• 1、材料和方法37-38
• 1.1 材料37
• 1.2 方法37-38
• 2、結(jié)果與分析38-40
• 2.1 篩選無(wú)乙酰膽堿酯酶靶標(biāo)抗性的單雌系38
• 2.2 單雌系羧酸酯酶、GST、P450 酶活性38-39
• 2.3 4 號(hào)單雌系的羧酸酯酶多態(tài)性39
• 2.4 4 號(hào)單雌系的抗性水平39-40
• 3、本章小結(jié)40-41
• 全文總結(jié)和展望41-42
• 參考文獻(xiàn)42-48
• 期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文48-49
• 致謝49

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

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8 常海靜;劉洋洋;江紅;喬傳令;盧希平;郎明林;崔峰;;酯酶顯色法快速檢測(cè)尖音庫(kù)蚊對(duì)有機(jī)磷的抗性[J];中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志;2011年04期

  本文關(guān)鍵詞：致倦庫(kù)蚊Chymotrypsin-like蛋白與有機(jī)磷抗性關(guān)系的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：445453