本文關(guān)鍵詞：人PTH的表達(dá)純化及其免疫吸附劑的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)是尿毒癥的主要毒性物質(zhì)之一,幾乎所有的腎衰竭患者體內(nèi)含有過高的PTH,過高的PTH使腎衰竭患者處于一種高危狀態(tài),嚴(yán)重影響腎衰竭患者生存質(zhì)量及生存率。目前針對高PTH的治療方法包括3種：藥物治療、外科手術(shù)和血液凈化。藥物和手術(shù)治療易復(fù)發(fā),且具有較大副作用。血液凈化方式被認(rèn)為是一種有效的、很有發(fā)展前景的治療方式。已有的血液凈化療法對PTH的去除能力有限且選擇性低。為了提高吸附劑的選擇性和安全性,本論文利用穩(wěn)定性高,安全性好的特異性IgY為配基,制備了以人PTH為目標(biāo)分子的免疫吸附劑并考察該吸附劑對PTH的吸附能力。本論文的研究內(nèi)容包括以下幾部分： (1)PTH的原核表達(dá)。通過基因工程技術(shù),分別構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET23a-PTH、 pET21b-PTH; PTH在含有pET23a-PTH和pET21b-PTH的E.coli BL21(DE3)中均獲得可溶表達(dá),其中E.coli BL21(DE3)-pET23a-PTH的表達(dá)量高,因此選擇pET23a-PTH作為目的蛋白表達(dá)的重組質(zhì)粒。通過對菌體的培養(yǎng)條件的優(yōu)化,確定了最終的培養(yǎng)條件為：菌體37℃活化過夜后,1%接菌于50mL LB培養(yǎng)基,培養(yǎng)3h后,0.1mMIPTG誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)4h,目的蛋白表達(dá)量約為0.1mg/mL,達(dá)到總蛋白的30%。 (2)PTH的純化。菌體經(jīng)冰浴超聲破碎,0.12%(w/v) PEI沉淀,50%飽和度的硫酸銨沉淀,pH3.5檸檬酸緩沖液等電點沉淀,SP強(qiáng)陽離子交換層析得到終產(chǎn)品。終產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE SEC-HPLC及RP-HPLC檢測,純度達(dá)到95%以上。對終產(chǎn)品進(jìn)行了鑒定分析,MALDI-TOF-MS測得分子量為9406.777Da,與理論分子量基本一致,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)其具有良好的免疫原性。 (3)PTH免疫吸附劑的制備。將獲得的PTH終產(chǎn)品作為抗原免疫蛋雞,經(jīng)Western blot和間接ELISA檢測所獲卵黃內(nèi)產(chǎn)生較高效價IgY特異性抗體；IgY經(jīng)去除脂質(zhì),硫酸銨沉淀等步驟初分離后,利用Sepharose-PTH免疫親和柱進(jìn)行親和純化,純度達(dá)92%；將純化得到的抗-PTH IgY固載于羰基二咪唑(N, N'-carbonyldiimidazole, CDI)活化的瓊脂糖凝膠上制備免疫吸附劑,吸附劑對各腎衰竭患者血清樣品中的PTH均有良好去除效果,去除率為40-60%。 總之,通過本論文的研究,獲得了對腎衰竭患者血清中PTH具有良好去除效果的免疫吸附劑,為其作為血液凈化裝置的吸附填料用于患者血液中甲狀旁腺激素的清除奠定了良好基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：甲狀旁腺激素 卵黃抗體 親和純化 免疫吸附
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392;Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-29
• 1.1 慢性腎衰竭11-12
• 1.1.1 慢性腎衰竭概述11-12
• 1.1.2 慢性腎衰竭的治療12
• 1.2 甲狀旁腺激素及其致病機(jī)理12-17
• 1.2.1 甲狀旁腺激素概述12-15
• 1.2.2 甲狀旁腺激素致病機(jī)理15
• 1.2.3 繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)的治療15-17
• 1.3 基因重組蛋白純化與鑒定技術(shù)17-22
• 1.3.1 蛋白純化技術(shù)的選擇策略與組合17-20
• 1.3.2 重組蛋白的定量與定性分析20-22
• 1.4 卵黃抗體技術(shù)22-27
• 1.4.1 卵黃抗體特征22-24
• 1.4.2 卵黃抗體的提取和分離純化24-26
• 1.4.3 卵黃抗體的檢測26-27
• 1.5 本論文的研究基礎(chǔ)、目標(biāo)和主要內(nèi)容27-29
• 2 重組蛋白PTH的原核表達(dá)29-42
• 2.1 緒論29
• 2.2 實驗材料29-31
• 2.2.1 材料和試劑29-30
• 2.2.2 主要儀器30-31
• 2.3 實驗方法31-35
• 2.3.1 目的基因的合成31-32
• 2.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建32-33
• 2.3.3 BCA法測定總蛋白含量33-34
• 2.3.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化34
• 2.3.5 重組蛋白的可溶性檢測34
• 2.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳34
• 2.3.7 瓊脂糖凝膠電泳34-35
• 2.4 實驗結(jié)果與討論35-40
• 2.4.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、目的片段轉(zhuǎn)化及蛋白表達(dá)35-37
• 2.4.2 重組蛋白的可溶性檢測37
• 2.4.3 重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化37-40
• 2.5 小結(jié)40-42
• 3 重組蛋白PTH的分離純化42-56
• 3.1 緒論42
• 3.2 實驗材料42-43
• 3.2.1 材料和試劑42
• 3.2.2 主要儀器42-43
• 3.3 實驗方法43-46
• 3.3.1 菌體的破碎43
• 3.3.2 聚乙烯亞胺沉淀43
• 3.3.3 硫酸銨沉淀43-44
• 3.3.4 等電點沉淀44
• 3.3.5 SP強(qiáng)陽離子交換層析44-45
• 3.3.6 重組蛋白的純度分析45
• 3.3.7 重組蛋白性質(zhì)檢測45-46
• 3.4 實驗結(jié)果與討論46-55
• 3.4.1 裂解緩沖液離子強(qiáng)度優(yōu)化46
• 3.4.2 聚乙烯亞胺沉淀條件優(yōu)化46-48
• 3.4.3 硫酸銨沉淀條件優(yōu)化48
• 3.4.4 等電點沉淀條件優(yōu)化48-49
• 3.4.5 SP強(qiáng)陽離子交換層析條件優(yōu)化49-51
• 3.4.6 重組蛋白的純度分析51-53
• 3.4.7 純化工藝總結(jié)53-54
• 3.4.8 重組蛋白性質(zhì)檢測54-55
• 3.5 小結(jié)55-56
• 4 PTH免疫吸附劑的制備及性能評價56-70
• 4.1 緒論56
• 4.2 實驗材料56-57
• 4.2.1 材料和試劑56-57
• 4.2.2 主要儀器57
• 4.3 實驗方法57-62
• 4.3.1 動物免疫57-58
• 4.3.2 Bradford法測定總蛋白含量58
• 4.3.3 IgY的分離提取58-59
• 4.3.4 IgY的特異性檢測59
• 4.3.5 IgY的效價檢測59-60
• 4.3.6 PTH免疫親和柱的制備60-61
• 4.3.7 IgY的親和純化61
• 4.3.8 IgY免疫吸附劑的制備61-62
• 4.3.9 IgY免疫吸附劑對PTH的親和常數(shù)測定62
• 4.3.10 IgY免疫吸附劑對PTH的去除效果評價62
• 4.3.11 IgY免疫吸附劑的特異性吸附評價62
• 4.4 實驗結(jié)果與討論62-69
• 4.4.1 IgY特異性檢測62-63
• 4.4.2 免疫后特異性IgY效價變化測定63-64
• 4.4.3 硫酸銨沉淀純化IgY條件優(yōu)化64-66
• 4.4.4 IgY的親和純化66-67
• 4.4.5 IgY免疫吸附劑對PTH的親和常數(shù)測定67-68
• 4.4.6 IgY免疫吸附劑對PTH的去除效果評價68
• 4.4.7 IgY免疫吸附劑的特異性吸附評價68-69
• 4.5 小結(jié)69-70
• 結(jié)論70-71
• 展望71-72
• 參考文獻(xiàn)72-77
• 附錄A 重組蛋白PTH(1-84)氨基酸序列77-78
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況78-79
• 致謝79-80

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：441933