本文關鍵詞：LSDP5在小鼠肝臟脂毒性損傷中的作用與初步機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前研究認為，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）發(fā)生的核心機制是脂毒性（Lipotoxicity）損傷，其中非酯化脂肪酸（NEFA）及其相關產(chǎn)物的代謝異常，是誘發(fā)脂毒性損傷的重要原因，而細胞內(nèi)脂肪酸主要以甘油三酯（TG）的形式儲存在脂滴（LD）中，因此脂滴的代謝異常與肝臟脂毒性損傷有著密切的關系。目前，脂滴被認為是一個代謝活躍的“細胞器”，在脂質儲存和代謝過程中具有重要的作用，而脂滴表面相關蛋白是調(diào)節(jié)脂滴代謝的重要分子。其中，PAT家族蛋白是一組最為重要的脂滴表面相關蛋白，LSDP5是PAT家族的第5個成員，主要分布在高氧化代謝的組織中，如肝臟、心肌、骨骼肌和BAT，又被稱為Perilipin5、OXPAT，或MLDP。然而，LSDP5在肝臟的具體生理學功能和作用機制尚不清楚。 本研究主要利用建立的LSDP5敲除小鼠模型，通過研究LSDP5敲除小鼠的主要表型變化，肝臟形態(tài)學與生理學功能的變化，以及LSDP5缺失對肝臟脂滴和線粒體相關分子表達水平的影響，最終闡明LSDP5在肝臟脂毒性損傷中的作用與初步分子機制。本研究結果不僅能夠使我們更加深刻地理解脂滴代謝過程與肝臟脂毒性損傷之間的關系，同時對脂肪肝、NASH等疾病的臨床診治也具有重要的意義。 1、LSDP5敲除小鼠表現(xiàn)出肝臟損傷。 通過分析LSDP5敲除小鼠生長繁殖狀況和基因型，我們沒有發(fā)現(xiàn)LSDP5敲除小鼠的生長和繁殖過程出現(xiàn)變化。同時，LSDP5敲除小鼠的體重、胰島素敏感性（GTT和ITT）和主要器官重量也未出現(xiàn)明顯變化。另外，我們發(fā)現(xiàn)，正常飲食和高脂飲食的LSDP5敲除小鼠，其血糖、血脂、血清總蛋白、白蛋白也未見明顯變化。然而，血液生化分析結果顯示，LSDP5敲除小鼠血清中ALT、AST、DB、TB均明顯升高。因此我們認為，LSDP5缺失能夠造成小鼠肝臟的損傷。 2、LSDP5敲除小鼠肝臟內(nèi)脂肪含量降低，且線粒體出現(xiàn)增殖。 為了明確LSDP5敲除小鼠肝臟損傷的主要表現(xiàn)，我們利用組織學研究方法，分析了LSDP5敲除小鼠肝臟形態(tài)的變化。HE染色結果顯示LSDP5敲除小鼠肝臟出現(xiàn)肝板結構紊亂、細胞核大小不一等損傷的表現(xiàn)，且高脂飲食小鼠的肝臟損傷表現(xiàn)更加明顯。油紅O染色結果顯示正常飲食和高脂飲食的LSDP5敲除小鼠肝臟中脂肪含量相對于野生型小鼠均明顯降低。同時，體外分離培養(yǎng)的LSDP5缺失肝細胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少，體積變小。電鏡觀察結果顯示LSDP5敲除小鼠肝臟中線粒體數(shù)量明顯增加，但體積相對變小。同時，MitoTracker染色結果也提示體外培養(yǎng)的LSDP5缺失肝細胞內(nèi)線粒體數(shù)量增加。而且，LSDP5敲除小鼠肝臟中線粒體的標志物Cox IV、Cytochrome C表達水平也升高。這些結果表明，LSDP5缺失能夠抑制肝細胞內(nèi)脂質的儲積，同時促進線粒體的增殖。 3、LSDP5敲除小鼠肝細胞內(nèi)脂肪酸氧化速率加快，造成脂質過氧化損傷。 為了確定LSDP5敲除小鼠肝臟中脂肪代謝過程的變化，我們利用3H標記的油酸（Oleic acid-[9,10-3H]）測定了LSDP5敲除小鼠肝細胞的脂肪酸氧化速率、TG合成和分泌速率。結果顯示LSDP5缺失肝細胞的脂肪酸β氧化速率加快，TG儲存量明顯減少，同時肝細胞分泌的TG也減少。進一步，我們發(fā)現(xiàn)正常飲食和高脂飲食的LSDP5敲除小鼠肝臟中MDA的水平均明顯升高，而抗過氧化的SOD水平降低。通過JC-1染色，我們發(fā)現(xiàn)LSDP5缺失肝細胞的線粒體膜電位降低。結合這些結果，我們認為LSDP5敲除小鼠肝臟線粒體數(shù)量增加，且脂肪酸氧化速率加快，從而造成肝細胞的脂質過氧化，這可能是LSDP5敲除小鼠肝臟損傷的一個重要原因。 4、LSDP5是一個脂滴表面蛋白，LSDP5敲除小鼠肝臟中PPARα和脂肪酸分解相關分子的表達水平升高，脂肪合成相關分子的表達水平降低。 我們利用細胞器分離技術和GFP融合蛋白進一步確定LSDP5的脂滴定位特性，結果發(fā)現(xiàn)LSDP5主要定位于脂滴，但同時也存在于細胞質中。同時確定了N端（1-128aa）是LSDP5脂滴定位的重要結構域。在基因芯片分析的基礎上，，我們利用Real-time PCR分析了LSDP5敲除小鼠肝臟中脂肪代謝相關分子的表達水平變化，結果顯示LSDP5敲除小鼠肝臟內(nèi)ADRP表達水平明顯降低，而TIP47表達水平升高；同時，線粒體功能相關分子Cox IV、Cytochrome C和CPT1a的表達水平均明顯升高，而脂肪合成過程的關鍵分子ACC1、ACC2、FAS等的表達水平均出現(xiàn)不同程度的降低。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)LSDP5敲除小鼠肝臟中脂肪代謝的關鍵調(diào)控分子PPARα在mRNA和蛋白質水平均有明顯升高。這些結果說明，LSDP5敲除小鼠肝臟中脂肪酸合成過程受到抑制，但分解過程增強，而PPARα表達水平增高可能是造成LSDP5敲除小鼠肝臟脂肪代謝變化的重要調(diào)控機制。 本研究利用LSDP5敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)LSDP5缺失能夠造成小鼠肝臟的脂毒性損傷。我們認為，作為PAT家族的重要成員，LSDP5主要定位于脂滴表面和細胞質，能夠抑制脂滴中TG的水解。LSDP5缺失肝細胞內(nèi)脂滴的水解速率加快，降低了肝細胞內(nèi)脂肪儲存量，同時增加了肝細胞內(nèi)NEFA的含量，進而激活PPARα，促進線粒體增殖，使脂肪酸的氧化速率加快，造成肝細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，從而造成肝臟的脂毒性損傷�；谶@些結果，我們將進一步研究LSDP5在脂滴代謝調(diào)控過程中的具體作用和分子機制。
【關鍵詞】：LSDP5 肝臟 脂滴 脂毒性 脂肪代謝 非酒精性脂肪性肝炎
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-14
• 文獻回顧14-23
• 第一部分 LSDP5 敲除小鼠的鑒定及一般表型分析23-34
• 1 實驗材料23-24
• 2 實驗方法24-26
• 3 實驗結果26-32
• 4 討論32-34
• 第二部分 LSDP5 敲除小鼠肝臟的形態(tài)學研究34-44
• 1 實驗材料34-35
• 2 實驗方法35-38
• 3 實驗結果38-42
• 4 討論42-44
• 第三部分 LSDP5 敲除小鼠肝臟的生理學研究44-53
• 1 實驗材料44-45
• 2 實驗方法45-47
• 3 實驗結果47-50
• 4 討論50-53
• 第四部分 LSDP5 敲除小鼠肝臟脂毒性損傷的分子機制研究53-69
• 1 實驗材料53-54
• 2 實驗方法54-59
• 3 實驗結果59-65
• 4 討論65-69
• 小結69-70
• 參考文獻70-75
• 個人簡歷和研究成果75-77
• 致謝77

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本文編號：440421