本文關(guān)鍵詞：抗MBL單抗1C8對(duì)人單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)作為人體天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體,近年來一直是天然免疫研究的熱點(diǎn)之一。MBL是由肝細(xì)胞分泌的膠原樣復(fù)合血漿蛋白,為C型凝集素家族成員。成熟的MBL肽鏈自N端至C端依次為富含半胱氨酸(Cys)的N末端區(qū)、膠原樣區(qū)(collagen-like region, CLR)、α螺旋構(gòu)成的頸區(qū)和C端的糖識(shí)別域(carbohydrate recognition domain, CRD)[2]。 MBL在機(jī)體天然免疫中有重要的抗感染作用,它利用CRD識(shí)別廣泛分布于多種病原體如細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等表面的糖蛋白或糖結(jié)構(gòu),例如D-甘露聚糖、鹽藻糖、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰葡萄糖胺等。其CLR與甘露聚糖相關(guān)絲氨酸蛋白酶(mannan-binding lectin associated serine protease, MASP1、MASP2、MASP3)結(jié)合形成MBL-MASPs復(fù)合物,激活補(bǔ)體介導(dǎo)的凝集素途徑而發(fā)揮調(diào)理功能；或者與吞噬細(xì)胞膠凝素受體(ClqR)結(jié)合,以不依賴于補(bǔ)體的方式啟動(dòng)調(diào)理吞噬。此外,球形結(jié)構(gòu)的CRD與某些病毒(如流感病毒A)結(jié)合后可直接中和病毒活性。血漿中的MBL是二至六聚體的混合物,只有三聚體及以上的高聚體MBL才能有效識(shí)別病原體表面的糖結(jié)構(gòu),進(jìn)而激活補(bǔ)體。 MBL在人血清中的含量很低,正常人平均含量為1mg/L。MBL亦是一種急性期反應(yīng)蛋白,在應(yīng)激狀態(tài)下(如外科手術(shù)、病原體感染、腫瘤等),其血漿濃度可升高2-3倍。MBL缺損患者處于高度的感染風(fēng)險(xiǎn)之中,表現(xiàn)為多種病原體的反復(fù)急慢性感染,然而MBL水平過高,可能會(huì)通過凝集素途徑而過度活化補(bǔ)體,導(dǎo)致機(jī)體的炎癥性損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道,高M(jìn)BL水平與缺血-再灌注損傷的炎癥反應(yīng)、糖尿病腎臟并發(fā)癥及原發(fā)性膽汁性淤積型肝硬化有關(guān)。相反,MBL水平低下,其激活補(bǔ)體的能力相對(duì)下降,則降低了炎癥介質(zhì)對(duì)宿主細(xì)胞的損傷。此外,高水平MBL可能會(huì)促進(jìn)吞噬細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)對(duì)胞內(nèi)寄生菌的攝取,如結(jié)核分枝桿菌和利什曼原蟲等,增加了病原體入侵的機(jī)會(huì),因此正常水平的MBL對(duì)機(jī)體尤為重要。眾所周知,單核巨噬細(xì)胞在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,并參與特異性免疫應(yīng)答。正常情況下單核巨噬細(xì)胞通過吞噬異物、細(xì)菌、衰老和突變的細(xì)胞以及天然的免疫復(fù)合物維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,富含MBL的人血清能促進(jìn)吞噬細(xì)胞的調(diào)理吞噬功能。 鑒于上述MBL的重要作用和商品化抗MBL抗體的昂貴價(jià)格,本科室制備了一系列抗MBL單克隆抗體,并從中篩選了一株功能性單抗1C8。有研究表明,MBL能增強(qiáng)補(bǔ)體的活化和促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬病原體,但是抗MBL單抗對(duì)單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬的作用目前尚未見報(bào)道,故本課題組以單核巨噬細(xì)胞為切入點(diǎn),初步探索1C8對(duì)單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響及其作用機(jī)制。我們首先鑒定了抗MBL抗體1C8的純度和生物學(xué)活性,它能與本科室提取的天然有活性的MBL和商品MBL以劑量依賴的形式結(jié)合,并初步探討了1C8對(duì)混合人血清刺激的單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響及其作用機(jī)制。 第一章抗MBL單克隆抗體1C8的純化和鑒定 隨著對(duì)MBL研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其除了能識(shí)別并清除病原體之外,還有許多內(nèi)源性功能(endogenous function),例如識(shí)別缺血-再灌注損傷中暴露的自身抗原、參與吞噬凋亡細(xì)胞、結(jié)合腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮MBL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等,但是抗MBL抗體有關(guān)的報(bào)道甚少。目前市場(chǎng)上已經(jīng)有商品的抗MBL單克隆抗體,但是因?yàn)槠鋬r(jià)格昂貴,令人望而卻步,而且其針對(duì)的是真核表達(dá)的商品MBL,而不是天然純化的MBL。本課題組多年以來一直致力于天然MBL的純化和相關(guān)功能的研究,尤其是純化分離MBL的技術(shù)已經(jīng)成熟。鑒于此,本科室制備了以天然純化的MBL為抗原的單克隆抗體(1C8等)。本部分工作主要是鑒定1C8的純度和生物學(xué)活性。 首先復(fù)蘇本科室已經(jīng)制備并保存在液氮的雜交瘤細(xì)胞株1C8,然后制備單克隆抗體腹水,經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法(CA-AS)純化腹水中的單克隆抗體,進(jìn)一步我們分別運(yùn)用SDS-PAGE和Western-blot鑒定了1C8的純度與特異性,并通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbence assay, ELISA)同商品化的抗MBL抗體HYB131-11做了比較,檢測(cè)了1C8的敏感性。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析,1C8不僅能與本科室自提天然有活性的MBL結(jié)合良好,亦能與商品MBL結(jié)合,而且同商品化的抗MBL抗體HYB131-11沒有顯著區(qū)別。以上結(jié)果表明1C8有良好的結(jié)合MBL的生物學(xué)活性,為1C8的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第二章1C8對(duì)人單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響 有研究表明,富含MBL的人血清能促進(jìn)吞噬細(xì)胞的調(diào)理吞噬和增強(qiáng)補(bǔ)體的活化,但是凝集素途徑過強(qiáng)則會(huì)導(dǎo)致炎癥性損傷。單核巨噬細(xì)胞作為專職的抗原遞呈細(xì)胞,它通過吞噬衰老的細(xì)胞和病原體等維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。本部分工作主要是分離和培養(yǎng)人單核巨噬細(xì)胞,旨在探討1C8對(duì)含MBL的混合人血清誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響。 無菌分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monoeuclear cell, PBMC),用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)分析時(shí),將1C8/IgG、10%滅活/未滅活混合人血清和FITC-白色念珠菌預(yù)先孵育30min后加入到PBMC中,37℃搖床孵育30min,然后檢測(cè)1C8對(duì)CD14+的單核細(xì)胞吞噬FITC-白色念珠菌的影響。在用熒光顯微鏡觀察1C8對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響時(shí),預(yù)先將PBMC貼壁2h,待貼壁細(xì)胞形態(tài)良好時(shí)加入50ng/ml的M-CSF,培養(yǎng)9d。FCM結(jié)果顯示,1C8能抑制混合人血清誘導(dǎo)的單核細(xì)胞吞噬FITC-白色念珠菌,而且能降低到無補(bǔ)體的滅活血清水平。在熒光顯微鏡下觀察1C8對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬FITC-白色念珠菌的影響與FCM的結(jié)果一致,表現(xiàn)為1C8組的巨噬細(xì)胞吞噬FITC-白色念珠菌的數(shù)目減少。以上結(jié)果為1C8直接調(diào)節(jié)MBL介導(dǎo)的凝集素途徑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。尚需要進(jìn)一步解決的問題是：1C8與MBL結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的初步確定；1C8對(duì)其他免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用等。 第三章1C8對(duì)人單核巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的機(jī)制初探 為了初步探討1C8對(duì)單核巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的作用機(jī)制,首先我們重組表達(dá)了人MBL-CRD蛋白(recombinant human MBL-CRD, rhMBL-CRD),并對(duì)其進(jìn)行了SDS-PAGE和Western-blot鑒定。采用ELISA研究1C8與rhMBL-CRD、 MASP-1C、MASP-2C和MASP-2N蛋白的結(jié)合,并用SDS-PAGE和Western-blot鑒定1C8與rhMBL-CRD、rhMBL-CLR結(jié)合的特異性。用直接ELISA分析甘露聚糖(mannan)、甘露糖(mannose)、D-半乳糖、D-半乳糖胺、D-甘露糖胺和D-葡萄糖胺對(duì)HRP-1C8結(jié)合rhMBL-CRD的影響。并用凝集實(shí)驗(yàn)觀察1C8對(duì)rhMBL-CRD結(jié)合FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠菌的影響。rhMBL-CRD的Western-blot結(jié)果提示,rhMBL-CRD能與本科室制備的抗MBL-CRD單克隆抗體結(jié)合良好,在43KD處有明顯條帶。ELISA結(jié)果顯示1C8能以劑量依賴的方式結(jié)合rhMBL-CRD,但不與MASP-1C、MASP-2C和MASP-2N蛋白結(jié)合,同Western-blot的結(jié)果一致。直接ELISA的結(jié)果表明,1C8與rhMBL-CRD的結(jié)合能被上述六種糖所阻斷,隨著糖濃度的降低,1C8與rhMBL-CRD的結(jié)合增強(qiáng)。在熒光顯微鏡下觀察FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠菌的凝集,發(fā)現(xiàn)1C8能阻斷FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠菌與rhMBL-CRD的結(jié)合,而作為1C8對(duì)照的IgG組則沒有區(qū)別。以上結(jié)果提示1C8通過CRD結(jié)合MBL,并通過與病原體表面的糖結(jié)構(gòu)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CRD而阻斷MBL介導(dǎo)的凝集素途徑。 綜上,本研究發(fā)現(xiàn),抗MBL單克隆抗體1C8可與本科室自提天然有活性的MBL及商品MBL結(jié)合,而且與商品化的抗MBL抗體HYB131-11沒有區(qū)別。通過檢測(cè)1C8對(duì)混合人血清刺激的單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響及1C8與MBL結(jié)合部位的確定,初步獲得了1C8應(yīng)用價(jià)值的證據(jù)。但是1C8對(duì)MBL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用,以及對(duì)其它免疫細(xì)胞的影響均需要進(jìn)一步的研究。下一步工作將繼續(xù)探索1C8對(duì)單核巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子和凋亡的影響,并進(jìn)一步研究1C8對(duì)T細(xì)胞、NK細(xì)胞等的調(diào)節(jié)作用。本研究將為1C8的后續(xù)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為高水平MBL有關(guān)疾病的防治研究提供新的理論依據(jù)和靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：抗MBL單克隆抗體(1C8) 單核巨噬細(xì)胞 糖識(shí)別域 調(diào)理吞噬
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-18
• 第一章 抗人MBL單克隆抗體1C8的純化和鑒定18-28
• 1.1 材料和方法18-24
• 1.2 結(jié)果24-27
• 1.3 討論27-28
• 第二章 1C8對(duì)人單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響28-37
• 2.1 材料和方法28-31
• 2.2 結(jié)果31-33
• 2.3 討論33-37
• 第三章 1C8對(duì)人單核巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的機(jī)制初探37-54
• 3.1 材料與方法37-48
• 3.2 結(jié)果48-52
• 3.3 討論52-54
• 全文總結(jié)54-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 中英文對(duì)照縮略詞語表60-62
• 在讀期間發(fā)表及待發(fā)表的文章62-63
• 致謝63-65

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