本文關(guān)鍵詞：siRNA靶向抑制肝素生物合成酶NDST-2以揭示肝素在肥大細(xì)胞中的天然活性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝素(Heparin, Hep)是由不同硫酸化程度的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸／艾杜糖醛酸二糖單位所組成的粘多糖,是目前臨床上最重要的抗凝血和抗血栓藥物。然而,凝血因子FXa和FIIa一直存在于血液中,而Hep則僅由肥大細(xì)胞合成、貯存和釋放,只有在受到刺激時(shí)才釋放出來(lái)。血液持續(xù)在血管中流動(dòng)而不發(fā)生血栓的原因在于與血液直接接觸的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)有與Hep類似的抗凝物質(zhì)——硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate, HS)。故Hep在肥大細(xì)胞內(nèi)的天然活性并不是抗凝。已有證據(jù)表明,Hep的強(qiáng)電負(fù)性使其與肥大細(xì)胞顆粒中多種物質(zhì)的貯存及活性的發(fā)揮密切相關(guān),但這些研究大多是在細(xì)胞外、分子水平上進(jìn)行的。Hep作為肥大細(xì)胞顆粒中的重要組成成分,在研究其天然活性時(shí),必需要以肥大細(xì)胞為對(duì)象來(lái)進(jìn)行。 Hep生物合成是在以N-乙酰葡糖胺和D-普通糖醛酸為雙糖單位聚合的未硫酸化的多糖鏈上逐步完成的,共包括五步反應(yīng),第一步是GlcNAc的N-脫乙酰、N-硫酸化。該步反應(yīng)是Hep生物合成中至關(guān)重要的一步反應(yīng)。N-脫乙酰-N-磺基轉(zhuǎn)移酶(N-deacetylase/N-sulfotransferase, NDST)-2即為催化該步反應(yīng)的酶類。理論上來(lái)講,抑制該步反應(yīng)必然會(huì)導(dǎo)致Hep生物合成的阻斷,從而使肥大細(xì)胞顆粒內(nèi)出現(xiàn)Hep缺失。慢病毒載體是一類重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,其優(yōu)點(diǎn)有感染效率高,可有效感染原代細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞,能夠?qū)崿F(xiàn)攜帶基因片段的穩(wěn)定表達(dá)等。 本課題即采用慢病毒載體特異性抑制大鼠腹腔肥大細(xì)胞(Rat peritoneal mast cells, RPMC)內(nèi)的NDST-2,制造Hep合成受阻的肥大細(xì)胞,考察此時(shí)RPMC形態(tài)變化、顆粒內(nèi)介質(zhì)含量及脫顆粒過(guò)程,進(jìn)而探討Hep在肥大細(xì)胞內(nèi)的天然活性。 本課題的研究?jī)?nèi)容及成果主要包括四個(gè)文面： 1RPMC的分離及鑒定 提取大鼠腹腔懸液并采用梯度密度離心法分離純化RPMC,經(jīng)阿利新藍(lán)-蕃紅染色法、硫酸小檗堿染色法鑒別確定所提細(xì)胞主要為RPMC,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面IgE抗體鑒定其純度達(dá)88.3%。確立了RPMC的分離方法。 2RPMC的體外長(zhǎng)期培養(yǎng) 系統(tǒng)采用不同濃度的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Stem cell factor, SCF)、白介素3(Interleukin-3, IL-3)和白介素4(Interleukin-4, IL-4)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用體外培養(yǎng)RPMC,分別于第7、14、21天進(jìn)行阿利新藍(lán)-蕃紅染色法觀察其對(duì)RPMC存活及Hep表達(dá)情況的影響,選擇RPMC長(zhǎng)期存活且Hep表達(dá)情況最佳的培養(yǎng)條件為模型條件以進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示SCF是維持RPMC存活的必要條件,目.單獨(dú)使用SCF對(duì)RPMC中Hep表達(dá)最有利。IL-3的使用則會(huì)促進(jìn)RPMC分化,由合成Hep轉(zhuǎn)為合成硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate, CS)。IL-4也有一定促分化作用,但不如IL-3強(qiáng)。 3慢病毒介導(dǎo)抑制RPMC中NDST-2的表達(dá) 以陰性對(duì)照慢病毒分別在有無(wú)聚凝胺的條件下以1、10、50、100感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection, MOI)感染RPMC,熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光細(xì)胞比例來(lái)確定最佳感染條件。以最佳感染條件分別將4種NDST-2慢病毒感染RPMC, western-blot檢測(cè)其NDST-2表達(dá)情況以篩選最佳干擾序列。結(jié)果顯示在5μg/mL polybrene, MOI為100時(shí)為最佳感染條件,感染效率可達(dá)90%。NDST-24號(hào)慢病毒干擾效果最佳,抑制率可達(dá)90%以上 4NDST-2抑制后RPMC生物學(xué)活性的變化 NDST-24號(hào)慢病毒感染RPMC,在第6、12、18天進(jìn)行阿利新藍(lán)-蕃紅染色,觀察NDST-2抑制后Hep表達(dá)情況,選擇最佳檢測(cè)時(shí)間。進(jìn)行NDST-2抑制后RPMC顆粒內(nèi)介質(zhì)含量的檢測(cè)及脫顆粒介質(zhì)釋放率的檢測(cè),FM4-64膜熒光染料染色觀察脫顆粒時(shí)細(xì)胞變化。結(jié)果顯示感染第12天為最佳檢測(cè)時(shí)間,胞內(nèi)Hep表達(dá)大幅下降。組胺、類胰蛋白酶含量均有不同程度的下降,β-氨基已糖苷酶含量則無(wú)明顯變化。NDST-2干擾組脫顆粒程度較陰性對(duì)照組要低。 以上結(jié)果表明,Hep在肥大細(xì)胞的作用為輔助肥大細(xì)胞顆粒貯存組胺、類胰蛋白酶等生物活性物質(zhì),且可對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒程度產(chǎn)生影響。
【關(guān)鍵詞】：肝素 肥大細(xì)胞 慢病毒干擾 脫顆粒 N-脫乙酰-N-磺基轉(zhuǎn)移酶-2
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要10-12
• ABSTRACT12-15
• 符號(hào)說(shuō)明15-16
• 第一章 前言16-24
• 1 肝素的結(jié)構(gòu)16-17
• 2 肝素的生物合成過(guò)程17-18
• 3 肝素的關(guān)鍵生物合成酶18-19
• 3.1 NDSTs18-19
• 3.2 另外四種肝素生物合成關(guān)鍵酶19
• 4 肝素與肥大細(xì)胞亞型19-20
• 5 肥大細(xì)胞中肝素作用的初步研究20-21
• 6 慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)簡(jiǎn)介21-22
• 7 本課題的研究?jī)?nèi)容22-24
• 第二章 大鼠腹腔肥大細(xì)胞的分離與鑒定24-31
• 1 材料24-25
• 1.1 試劑24
• 1.2 動(dòng)物24
• 1.3 儀器24-25
• 2 方法25-27
• 2.1 溶液配制25
• 2.2 RPMC提取25-26
• 2.3 阿利新藍(lán)-蕃紅染色法鑒別RPMC26
• 2.4 硫酸小檗堿染色法鑒別RPMC26-27
• 2.5 流式細(xì)胞術(shù)間標(biāo)法鑒定RPMC純度27
• 3 結(jié)果27-29
• 3.1 RPMC提取27
• 3.2 阿利新藍(lán)-蕃紅染色法鑒別RPMC27-28
• 3.3 硫酸小檗堿染色法鑒別RPMC28-29
• 3.4 流式細(xì)胞術(shù)間標(biāo)法鑒定RPMC純度29
• 4 討論29-31
• 第三章 RPMC體外長(zhǎng)期培養(yǎng)31-43
• 1 材料31-32
• 1.1 試劑31-32
• 1.2 動(dòng)物32
• 1.3 儀器32
• 2 方法32-34
• 2.1 溶液配制32
• 2.2 RPMC提取32
• 2.3 RPMC培養(yǎng)32-33
• 2.4 阿利新藍(lán)-蕃紅染色33-34
• 3 結(jié)果34-40
• 3.1 培養(yǎng)第7天阿利新藍(lán)-蕃紅染色34-37
• 3.2 培養(yǎng)第14天阿利新藍(lán)-蕃紅染色37-39
• 3.3 培養(yǎng)第21天阿利新監(jiān)-蕃紅染色39-40
• 4 討論40-43
• 第四章 慢病毒介導(dǎo)抑制RPMC中NDST-2表達(dá)43-57
• 1 材料43-44
• 1.1 試劑43-44
• 1.2 動(dòng)物44
• 1.3 儀器44
• 2 方法44-49
• 2.1 溶液配制44-46
• 2.2 慢病毒最佳感染條件的確定46
• 2.3 嘌呤霉素RPMC細(xì)胞最低至死濃度篩選46
• 2.4 Western Blot篩選最佳干擾序列46-49
• 3 結(jié)果49-55
• 3.1 慢病毒在RPMC中最佳感染條件的確定49-54
• 3.2 嘌呤霉素RPMC細(xì)胞最低至死濃度54
• 3.3 Western Blot篩選最佳干擾序列54-55
• 4 討論55-57
• 第五章 NDST-2抑制后RPMC形態(tài)及脫顆粒功能的變化57-70
• 1 材料57-58
• 1.1 試劑57-58
• 1.2 動(dòng)物58
• 1.3 儀器58
• 2 方法58-60
• 2.1 溶液配制58-59
• 2.2 阿利新藍(lán)-蕃紅染色觀察RPMC中肝素含量及細(xì)胞形態(tài)變化59
• 2.3 慢病毒干擾NDS-2合成后RPMC脫顆粒介質(zhì)的檢測(cè)59-60
• 2.4 熒光觀察慢病毒于擾NDS-2后RPMC脫顆粒過(guò)程60
• 3 結(jié)果60-66
• 3.1 阿利新藍(lán)-蕃紅染色觀察干擾后的RPMC61-62
• 3.2 慢病毒干擾后脫顆粒介質(zhì)的檢測(cè)62-64
• 3.3 熒光觀察慢病毒干擾后RPMC脫顆粒過(guò)程64-66
• 4 討論66-70
• 4.1 阿利新藍(lán)-蕃紅染色觀察干擾后的RPMC66-67
• 4.2 NDST-2干擾后RPMC胞內(nèi)介質(zhì)含量的變化67-68
• 4.3 NDST-2干擾后RPMC脫顆粒反應(yīng)的變化68-70
• 總結(jié)70-71
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 致謝76-77
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文77-78
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表78

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 何韶衡;肝素對(duì)人肥大細(xì)胞組胺分泌的調(diào)節(jié)作用[J];免疫學(xué)雜志;2004年06期

  本文關(guān)鍵詞：siRNA靶向抑制肝素生物合成酶NDST-2以揭示肝素在肥大細(xì)胞中的天然活性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：436249