本文關鍵詞：乙型腦炎病毒入侵神經細胞的內吞機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），在分類學上屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）成員，為有包膜的單正鏈RNA病毒。JEV是流行性乙型腦炎的病原體，主要以蚊蟲為媒介進行傳播，感染后引發(fā)嚴重的急性神經系統(tǒng)癥狀，對人類健康威脅巨大。乙型腦炎主要流行于東亞、東南亞地區(qū)，近年來其傳播范圍有明顯擴大的趨勢，發(fā)病率也有所上升，可見JEV感染仍然是危害公眾健康的重大問題，急需深入研究JEV的致病機理并尋找新的抗病毒靶點。 病毒感染宿主細胞需要經過一個完整的復制周期，包括病毒的吸附、穿入細胞內、脫殼、生物合成、病毒顆粒的裝配、釋放等過程，這本身也是病毒與宿主細胞相互作用。為了有效感染宿主細胞，病毒必須先要侵入宿主細胞內，大多數包膜病毒與靶細胞結合以后利用細胞內吞方式作為侵入宿主細胞的途徑，這些內吞途徑包括：網格蛋白介導的內吞（Clathrin-mediated endocytosis）、膜穴樣凹陷介導的內吞（Caveola-mediated endocytosis）、巨胞飲作用（Macropinocytosis）和網格蛋白、膜穴樣凹陷非依賴型內吞（Clathrin-and Caveola-independent endocytosis）等。黃病毒屬病毒入胞途徑多樣且復雜，甚至同一種病毒的不同亞型入侵同一種細胞的內吞機制也不相同；然而，關于JEV如何利用宿主細胞固有運輸元件完成病毒內吞，及其精確的調控機制未見報道。 本課題以大鼠神經母細胞瘤細胞（B104細胞）為研究對象，針對JEV（疫苗株SA14-14-2株）的入胞過程，通過化學抑制劑阻斷、細胞內過表達顯性抑制突變體以及RNA干擾（RNAi）等方法，系統(tǒng)分析了JEV利用何種宿主細胞元件，通過何種內化途徑侵入神經細胞。本研究首先建立了JEV感染的神經細胞模型，并通過病毒動力學實驗，分析JEV入侵B104細胞的內化速率及動力學特征。然后，選用針對不同細胞內吞途徑的化學抑制劑分別阻斷各條內吞途徑，包括網格蛋白依賴的途徑、膜穴樣凹陷依賴的途徑、發(fā)動蛋白（Dynamin）依賴的途徑、膽固醇（Cholesterol）依賴的途徑、以及低pH依賴的途徑等，觀察上述處理對JEV和單周期JEV假病毒（JEVpv）入侵神經細胞的影響。繼而，通過外源轉染特異性的顯性抑制突變體或小干擾RNA，破壞各內吞途徑的關鍵分子，進一步分析和確認JEV入侵所依賴的內吞途徑。在以上研究基礎上，通過化學抑制劑阻斷法，觀察JEV不同基因型病毒株入侵B104細胞的內吞途徑是否存在株特異性；同時，采用化學抑制劑阻斷法比較分析JEV入侵神經細胞和非神經細胞的內吞途徑的異同。 本研究的主要結果和結論如下： 1. JEV入侵大鼠神經母細胞瘤細胞不依賴網格蛋白介導的內吞途徑 通過網格蛋白抑制劑Chlorpromazine、細胞內過表達EPS15蛋白顯性抑制突變體以及下調網格蛋白表達等方法，可阻斷網格蛋白介導的內吞途徑；然而上述處理并不影響JEV和JEVpv的入侵，提示JEV入侵B104細胞不通過網格蛋白依賴型內吞途徑。 2. JEV入侵大鼠神經母細胞瘤細胞依賴發(fā)動蛋白 利用發(fā)動蛋白抑制劑Dynasore、外源轉染Dynamin II K44A顯性抑制突變體或針對Dynamin的特異性小干擾RNA，能夠破壞發(fā)動蛋白的功能，并明顯抑制了JEV和JEVpv的內吞，表明JEV入侵B104細胞依賴發(fā)動蛋白的作用。 3. JEV通過膜穴樣凹陷（Caveola）介導的內吞途徑入侵大鼠神經母細胞瘤細胞 當B104細胞與膽固醇抑制劑MβCD和Filipin作用后，細胞膜膽固醇及Caveola的結構完整性被破壞。這兩種抑制劑能夠明顯的抑制JEV和JEVpv的入侵，提示JEV的入侵依賴膽固醇和Caveola。在靶細胞內過表達Caveolin-1顯性抑制突變體或下調Caveolin-1的表達，可阻斷Caveola介導內吞的功能，并顯著抑制了JEV的入侵能力。此外，采用化學抑制劑Genistein抑制Caveola內吞途徑的信號通路，也能夠明顯地抑制JEVpv的內吞。為了更直觀的檢測JEV的內吞途徑，我們通過免疫熒光法標記Caveola依賴型內吞途徑標志分子霍亂毒素B (CTB)以及Caveolin-1，并觀察在病毒內吞過程中它們與JEV病毒顆粒的分布情況。激光共聚焦結果顯示，絕大多數JEV病毒顆粒與胞內CTB以及Caveolin-1分子共定位。以上結果表明JEV通過膜穴樣凹陷（Caveola）介導的內吞途徑入侵B104細胞。 4. JEV入侵大鼠神經母細胞瘤細胞不依賴細胞巨胞飲作用 通過EIPA或Wortmannin阻斷細胞的巨胞飲途徑，或干擾PI3K表達以抑制巨胞飲依賴的信號通路，均不能抑制JEV和JEVpv的入侵，提示JEV入侵不依賴細胞巨胞飲作用。 5. JEV入侵大鼠神經母細胞瘤細胞依賴酸性pH環(huán)境 利用內體酸化抑制劑Chloroquine和Ammonium Chloride來提升內體pH能夠明顯抑制JEV的入侵。在維持內體低pH環(huán)境中發(fā)揮質子泵作用的VATPase被下調后，JEVpv的感染能力也受到顯著抑制，提示JEV入侵依賴內體酸性pH環(huán)境。 6. JEV入侵大鼠神經母細胞瘤細胞的內吞途徑不存在株特異性 采用不同化學抑制劑阻斷各條內吞途徑，分析對JEV基因III型病毒株SA14和基因I型病毒株SH-53入侵的影響。我們發(fā)現，這兩種基因型的JEV病毒株與疫苗株SA14-14-2株的入侵方式相同，均通過Caveola介導的、發(fā)動蛋白和pH依賴型的內吞途徑入胞，表明JEV入侵B104細胞所依賴的內吞途徑不存在株特異性。 7. JEV入侵非神經類細胞不同于入侵大鼠神經母細胞瘤細胞所依賴的內吞途徑 分別將針對不同內吞途徑的化學抑制劑作用于B104、Vero、CHO和Huh7細胞分析對JEV入侵的影響。結果顯示，JEV通過網格蛋白介導的內吞途徑入侵Vero，CHO和Huh7細胞；而入侵B104細胞則通過Caveola介導的內吞途徑，提示JEV入侵神經類細胞所依賴的內吞途徑不同于其它非神經細胞。 綜上所述，本研究系統(tǒng)的分析了JEV入侵大鼠神經母細胞瘤細胞的內吞途徑及作用機制，證明JEV入侵B104細胞是通過膜穴樣凹陷（Caveola）介導的、發(fā)動蛋白和pH依賴型的內吞途徑。這種內吞途徑有別于JEV感染非神經細胞的入侵方式，也與其它黃病毒屬成員的內吞機制不同，可能與JEV的神經嗜性和致病性相關。闡明JEV入侵神經細胞過程中所利用的固有元件，，以及精確的調控機制，有助于我們更好地理解、認識病毒的致病機理，為尋找新的藥物治療靶點提供理論依據。
【關鍵詞】：乙型腦炎病毒 入侵 神經細胞 內吞途徑
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.31
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文縮略詞表11-13
• 一、前言13-15
• 二、材料15-21
• 三、實驗方法21-28
• （一）細胞培養(yǎng)21
• （二）JEV 擴增及滴度測定21-22
• （三）JEV 感染實驗及感染性測定22-23
• （四）JEV 假病毒的制備及感染23
• （五）JEV 結合及入侵動力學實驗23-24
• （六）化學抑制劑作用24-25
• （七）細胞轉染25
• （八）免疫熒光25-26
• （九）免疫印跡（Western blotting）26-27
• （十）膽固醇定量實驗27
• （十一）統(tǒng)計學分析27-28
• 四、結果28-57
• （一）JEV 入侵大鼠神經母細胞瘤細胞的動力學特征28-30
• （二）JEV 入侵大鼠神經母細胞瘤細胞不依賴網格蛋白介導的內吞途徑30-35
• （三）JEV 入侵大鼠神經母細胞瘤細胞依賴發(fā)動蛋白35-40
• （四）JEV 通過膜穴樣凹陷（Caveola）介導的內吞途徑入侵大鼠神經母細胞瘤細胞40-47
• （五）JEV 入侵大鼠神經母細胞瘤細胞不依賴細胞巨胞飲作用47-49
• （六）JEV 入侵大鼠神經母細胞瘤細胞依賴酸性 pH 環(huán)境49-53
• （七）JEV 不利用網格蛋白介導的內吞途徑和巨胞飲作用作為細胞入侵的次要途徑53-54
• （八）JEV 入侵大鼠神經母細胞瘤細胞的內吞途徑不存在株特異性54-55
• （九）JEV 入侵非神經類細胞不同于入侵大鼠神經母細胞瘤細胞所依賴的內吞途徑55-57
• 五、討論57-61
• 參考文獻61-67
• 文獻綜述67-74
• 參考文獻71-74
• 附錄74-75
• 致謝75-76

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 孫芳;李玉霞;凌焱;梁龍;陳珊;陳惠鵬;;病毒入胞機制研究方法及其研究進展[J];微生物學通報;2010年01期

  本文關鍵詞：乙型腦炎病毒入侵神經細胞的內吞機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：432858