本文關(guān)鍵詞：乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型腦炎病毒又稱(chēng)日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），在分類(lèi)學(xué)上屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）成員，為有包膜的單正鏈RNA病毒。JEV是流行性乙型腦炎的病原體，主要以蚊蟲(chóng)為媒介進(jìn)行傳播，感染后引發(fā)嚴(yán)重的急性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，對(duì)人類(lèi)健康威脅巨大。乙型腦炎主要流行于東亞、東南亞地區(qū)，近年來(lái)其傳播范圍有明顯擴(kuò)大的趨勢(shì)，發(fā)病率也有所上升，可見(jiàn)JEV感染仍然是危害公眾健康的重大問(wèn)題，急需深入研究JEV的致病機(jī)理并尋找新的抗病毒靶點(diǎn)。 病毒感染宿主細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)一個(gè)完整的復(fù)制周期，包括病毒的吸附、穿入細(xì)胞內(nèi)、脫殼、生物合成、病毒顆粒的裝配、釋放等過(guò)程，這本身也是病毒與宿主細(xì)胞相互作用。為了有效感染宿主細(xì)胞，病毒必須先要侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，大多數(shù)包膜病毒與靶細(xì)胞結(jié)合以后利用細(xì)胞內(nèi)吞方式作為侵入宿主細(xì)胞的途徑，這些內(nèi)吞途徑包括：網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞（Clathrin-mediated endocytosis）、膜穴樣凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞（Caveola-mediated endocytosis）、巨胞飲作用（Macropinocytosis）和網(wǎng)格蛋白、膜穴樣凹陷非依賴(lài)型內(nèi)吞（Clathrin-and Caveola-independent endocytosis）等。黃病毒屬病毒入胞途徑多樣且復(fù)雜，甚至同一種病毒的不同亞型入侵同一種細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制也不相同；然而，關(guān)于JEV如何利用宿主細(xì)胞固有運(yùn)輸元件完成病毒內(nèi)吞，及其精確的調(diào)控機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。 本課題以大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（B104細(xì)胞）為研究對(duì)象，針對(duì)JEV（疫苗株SA14-14-2株）的入胞過(guò)程，通過(guò)化學(xué)抑制劑阻斷、細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)顯性抑制突變體以及RNA干擾（RNAi）等方法，系統(tǒng)分析了JEV利用何種宿主細(xì)胞元件，通過(guò)何種內(nèi)化途徑侵入神經(jīng)細(xì)胞。本研究首先建立了JEV感染的神經(jīng)細(xì)胞模型，并通過(guò)病毒動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，分析JEV入侵B104細(xì)胞的內(nèi)化速率及動(dòng)力學(xué)特征。然后，選用針對(duì)不同細(xì)胞內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑分別阻斷各條內(nèi)吞途徑，包括網(wǎng)格蛋白依賴(lài)的途徑、膜穴樣凹陷依賴(lài)的途徑、發(fā)動(dòng)蛋白（Dynamin）依賴(lài)的途徑、膽固醇（Cholesterol）依賴(lài)的途徑、以及低pH依賴(lài)的途徑等，觀(guān)察上述處理對(duì)JEV和單周期JEV假病毒（JEVpv）入侵神經(jīng)細(xì)胞的影響。繼而，通過(guò)外源轉(zhuǎn)染特異性的顯性抑制突變體或小干擾RNA，破壞各內(nèi)吞途徑的關(guān)鍵分子，進(jìn)一步分析和確認(rèn)JEV入侵所依賴(lài)的內(nèi)吞途徑。在以上研究基礎(chǔ)上，通過(guò)化學(xué)抑制劑阻斷法，觀(guān)察JEV不同基因型病毒株入侵B104細(xì)胞的內(nèi)吞途徑是否存在株特異性；同時(shí)，采用化學(xué)抑制劑阻斷法比較分析JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞途徑的異同。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1. JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞不依賴(lài)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑 通過(guò)網(wǎng)格蛋白抑制劑Chlorpromazine、細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)EPS15蛋白顯性抑制突變體以及下調(diào)網(wǎng)格蛋白表達(dá)等方法，可阻斷網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑；然而上述處理并不影響JEV和JEVpv的入侵，提示JEV入侵B104細(xì)胞不通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴(lài)型內(nèi)吞途徑。 2. JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞依賴(lài)發(fā)動(dòng)蛋白 利用發(fā)動(dòng)蛋白抑制劑Dynasore、外源轉(zhuǎn)染Dynamin II K44A顯性抑制突變體或針對(duì)Dynamin的特異性小干擾RNA，能夠破壞發(fā)動(dòng)蛋白的功能，并明顯抑制了JEV和JEVpv的內(nèi)吞，表明JEV入侵B104細(xì)胞依賴(lài)發(fā)動(dòng)蛋白的作用。 3. JEV通過(guò)膜穴樣凹陷（Caveola）介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 當(dāng)B104細(xì)胞與膽固醇抑制劑MβCD和Filipin作用后，細(xì)胞膜膽固醇及Caveola的結(jié)構(gòu)完整性被破壞。這兩種抑制劑能夠明顯的抑制JEV和JEVpv的入侵，提示JEV的入侵依賴(lài)膽固醇和Caveola。在靶細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)Caveolin-1顯性抑制突變體或下調(diào)Caveolin-1的表達(dá)，可阻斷Caveola介導(dǎo)內(nèi)吞的功能，并顯著抑制了JEV的入侵能力。此外，采用化學(xué)抑制劑Genistein抑制Caveola內(nèi)吞途徑的信號(hào)通路，也能夠明顯地抑制JEVpv的內(nèi)吞。為了更直觀(guān)的檢測(cè)JEV的內(nèi)吞途徑，我們通過(guò)免疫熒光法標(biāo)記Caveola依賴(lài)型內(nèi)吞途徑標(biāo)志分子霍亂毒素B (CTB)以及Caveolin-1，并觀(guān)察在病毒內(nèi)吞過(guò)程中它們與JEV病毒顆粒的分布情況。激光共聚焦結(jié)果顯示，絕大多數(shù)JEV病毒顆粒與胞內(nèi)CTB以及Caveolin-1分子共定位。以上結(jié)果表明JEV通過(guò)膜穴樣凹陷（Caveola）介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵B104細(xì)胞。 4. JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞不依賴(lài)細(xì)胞巨胞飲作用 通過(guò)EIPA或Wortmannin阻斷細(xì)胞的巨胞飲途徑，或干擾PI3K表達(dá)以抑制巨胞飲依賴(lài)的信號(hào)通路，均不能抑制JEV和JEVpv的入侵，提示JEV入侵不依賴(lài)細(xì)胞巨胞飲作用。 5. JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞依賴(lài)酸性pH環(huán)境 利用內(nèi)體酸化抑制劑Chloroquine和Ammonium Chloride來(lái)提升內(nèi)體pH能夠明顯抑制JEV的入侵。在維持內(nèi)體低pH環(huán)境中發(fā)揮質(zhì)子泵作用的VATPase被下調(diào)后，JEVpv的感染能力也受到顯著抑制，提示JEV入侵依賴(lài)內(nèi)體酸性pH環(huán)境。 6. JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的內(nèi)吞途徑不存在株特異性 采用不同化學(xué)抑制劑阻斷各條內(nèi)吞途徑，分析對(duì)JEV基因III型病毒株SA14和基因I型病毒株SH-53入侵的影響。我們發(fā)現(xiàn)，這兩種基因型的JEV病毒株與疫苗株SA14-14-2株的入侵方式相同，均通過(guò)Caveola介導(dǎo)的、發(fā)動(dòng)蛋白和pH依賴(lài)型的內(nèi)吞途徑入胞，表明JEV入侵B104細(xì)胞所依賴(lài)的內(nèi)吞途徑不存在株特異性。 7. JEV入侵非神經(jīng)類(lèi)細(xì)胞不同于入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞所依賴(lài)的內(nèi)吞途徑 分別將針對(duì)不同內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑作用于B104、Vero、CHO和Huh7細(xì)胞分析對(duì)JEV入侵的影響。結(jié)果顯示，JEV通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵Vero，CHO和Huh7細(xì)胞；而入侵B104細(xì)胞則通過(guò)Caveola介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，提示JEV入侵神經(jīng)類(lèi)細(xì)胞所依賴(lài)的內(nèi)吞途徑不同于其它非神經(jīng)細(xì)胞。 綜上所述，本研究系統(tǒng)的分析了JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的內(nèi)吞途徑及作用機(jī)制，證明JEV入侵B104細(xì)胞是通過(guò)膜穴樣凹陷（Caveola）介導(dǎo)的、發(fā)動(dòng)蛋白和pH依賴(lài)型的內(nèi)吞途徑。這種內(nèi)吞途徑有別于JEV感染非神經(jīng)細(xì)胞的入侵方式，也與其它黃病毒屬成員的內(nèi)吞機(jī)制不同，可能與JEV的神經(jīng)嗜性和致病性相關(guān)。闡明JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中所利用的固有元件，，以及精確的調(diào)控機(jī)制，有助于我們更好地理解、認(rèn)識(shí)病毒的致病機(jī)理，為尋找新的藥物治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：乙型腦炎病毒 入侵 神經(jīng)細(xì)胞 內(nèi)吞途徑
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R373.31
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文縮略詞表11-13
• 一、前言13-15
• 二、材料15-21
• 三、實(shí)驗(yàn)方法21-28
• （一）細(xì)胞培養(yǎng)21
• （二）JEV 擴(kuò)增及滴度測(cè)定21-22
• （三）JEV 感染實(shí)驗(yàn)及感染性測(cè)定22-23
• （四）JEV 假病毒的制備及感染23
• （五）JEV 結(jié)合及入侵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)23-24
• （六）化學(xué)抑制劑作用24-25
• （七）細(xì)胞轉(zhuǎn)染25
• （八）免疫熒光25-26
• （九）免疫印跡（Western blotting）26-27
• （十）膽固醇定量實(shí)驗(yàn)27
• （十一）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析27-28
• 四、結(jié)果28-57
• （一）JEV 入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)特征28-30
• （二）JEV 入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞不依賴(lài)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑30-35
• （三）JEV 入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞依賴(lài)發(fā)動(dòng)蛋白35-40
• （四）JEV 通過(guò)膜穴樣凹陷（Caveola）介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞40-47
• （五）JEV 入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞不依賴(lài)細(xì)胞巨胞飲作用47-49
• （六）JEV 入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞依賴(lài)酸性 pH 環(huán)境49-53
• （七）JEV 不利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和巨胞飲作用作為細(xì)胞入侵的次要途徑53-54
• （八）JEV 入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的內(nèi)吞途徑不存在株特異性54-55
• （九）JEV 入侵非神經(jīng)類(lèi)細(xì)胞不同于入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞所依賴(lài)的內(nèi)吞途徑55-57
• 五、討論57-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 文獻(xiàn)綜述67-74
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 附錄74-75
• 致謝75-76

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 孫芳;李玉霞;凌焱;梁龍;陳珊;陳惠鵬;;病毒入胞機(jī)制研究方法及其研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報(bào);2010年01期

  本文關(guān)鍵詞：乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：432858