本文關(guān)鍵詞：小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞的體外培養(yǎng)和兔角膜內(nèi)皮細胞的體外分離培養(yǎng)及共培養(yǎng)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：體外培養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞以及體外分離、培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細胞，了解這兩種細胞的體外增殖生長特性，并通過共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)誘導(dǎo)多潛能干細胞向角膜內(nèi)皮樣細胞分化，并觀察小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞與兔角膜內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)前后的形態(tài)學(xué)變化，檢測其功能性蛋白質(zhì)-水通道蛋白1（Aquaporin1,AQP1)的表達，為研究誘導(dǎo)多潛能干細胞向角膜內(nèi)皮細胞的分化提供實驗依據(jù)，以探討誘導(dǎo)后的誘導(dǎo)多潛能干細胞作為替代角膜內(nèi)皮細胞進行移植手術(shù)的種子細胞的可行性。 方法： 1、利用飼養(yǎng)層細胞法對小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞進行體外培養(yǎng)擴增以及傳代，觀察細胞的生長狀態(tài)。取P2細胞，并用Westernblotting對細胞進行鑒定。 2、揭膜法獲取新西蘭大白兔眼后彈力層及內(nèi)皮細胞層，置于細胞培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，觀察及描繪角膜內(nèi)皮細胞的生長狀態(tài)。取P1細胞，利用免疫組織化學(xué)鑒定角膜內(nèi)皮細胞的相對特異性蛋白質(zhì)-神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE）。 3、將小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞與兔角膜內(nèi)皮細胞分別接種于Transwell上、下兩室，經(jīng)共培養(yǎng)2周后，觀察誘導(dǎo)后的小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞的形態(tài)，免疫組織化學(xué)檢測AQP1的表達。 結(jié)果： 1、復(fù)蘇后的小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞進行體外培養(yǎng)擴增，復(fù)蘇2-3d后可見微小克隆出現(xiàn)，之后細胞體積增大，呈典型的克隆樣生長，克隆呈圓形或橢圓形，邊界清晰，折光性好，高倍鏡下形似鳥巢�？寺�(nèi)細胞排列緊密，細胞體積較小，細胞核大，核仁清晰，細胞核質(zhì)比例高；4-6d后鋪滿瓶底約80%左右可以進行傳代，傳代細胞增殖明顯快于原代細胞；3-4d細胞增長最為活躍。取P2細胞，Westernblotting檢測Sox2、Oct4以及Nanog三種轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)志蛋白均呈陽性。 2、揭摸法分離培養(yǎng)的原代兔角膜內(nèi)皮細胞，48h后大部分細胞已貼壁，未被吹散的成團細胞貼壁后開始向周邊移行增殖，5d后形成良好的單層，呈“鋪路石”狀，6-7d后細胞分裂旺盛，細胞形態(tài)變?yōu)殚L而扁平的梭形，呈現(xiàn)典型的成纖維細胞形態(tài)，10d后呈“漩渦”狀排列，中央細胞呈短梭形或三角形，周邊細胞失去固有形態(tài)，呈不規(guī)則性。2周后細胞達到80%融合，細胞呈六邊形，，緊密排列便可以進行傳代。傳代24h后，角膜內(nèi)皮細胞大部分已經(jīng)貼壁；細胞生長曲線基本呈“S”形，第2-5d生長活躍，為對數(shù)生長期，1周達生長密集狀態(tài)，形態(tài)呈橢圓形，并向多邊形變化；免疫組織化學(xué)檢測細胞NSE表達，胞漿見棕黃色粗大顆粒，染色呈陽性。 3、小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞與兔角膜內(nèi)皮細胞在Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)2周后，細胞形態(tài)無明顯改變，但免疫組織化學(xué)檢測誘導(dǎo)后的小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞的AQP1表達，胞膜染色呈陽性。 結(jié)論：通過上述方法可以成功獲得純度較高且活性較好的小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞以及兔角膜內(nèi)皮細胞；利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)可以成功誘導(dǎo)小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞表達角膜內(nèi)皮功能性蛋白質(zhì)AQP1，誘導(dǎo)多潛能干細胞具有向角膜內(nèi)皮細胞分化的潛能；誘導(dǎo)后的誘導(dǎo)多潛能干細胞將來很有可能作為替代角膜內(nèi)皮細胞進行移植治療角膜內(nèi)皮病變和損傷的種子細胞。
【關(guān)鍵詞】：小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞 兔角膜內(nèi)皮細胞 分化 水通道蛋白1 共培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-13
• 材料和方法13-22
• 1. 材料13-14
• 2. 方法14-22
• 結(jié)果22-26
• 1. 小鼠 iPSCs 的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果22-23
• 2. RCECs 的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果23-25
• 3. 免疫組織化學(xué)染色檢測 AQP1 的表達25-26
• 討論26-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻31-34
• 綜述34-43
• 參考文獻40-43
• 致謝43-44

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 徐國興;;色素上皮細胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾�。簡栴}與展望[J];眼科;2007年04期

2 張純;;干細胞治療離青光眼患者有多遠?——十年干細胞研究的回顧[J];眼科;2009年01期

3 湯黎娜;張楊;宋光啟;施維;李子義;;誘導(dǎo)多功能干細胞的影響因素[J];中國細胞生物學(xué)學(xué)報;2011年04期

  本文關(guān)鍵詞：小鼠誘導(dǎo)多潛能干細胞的體外培養(yǎng)和兔角膜內(nèi)皮細胞的體外分離培養(yǎng)及共培養(yǎng)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：429911