本文關(guān)鍵詞：柴胡皂苷a人工抗原合成及其單克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：柴胡皂苷a是柴胡或狹葉柴胡的主要活性成分。柴胡是一種常用的傳統(tǒng)中藥,對(duì)其有效成分的分析有利于我們研究柴胡的藥理作用,而柴胡皂苷的含量分析是藥理作用研究中很重要的一部分,傳統(tǒng)的分析檢測(cè)方法如HPLC都需要比較麻煩的前處理過(guò)程。與這些常規(guī)方法相比,免疫分析方法具有選擇性高、靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn),在中藥現(xiàn)代化研究中具有其特有的優(yōu)勢(shì)。 目的： 用高碘酸鈉法合成柴胡皂苷a的人工抗原并進(jìn)行鑒定,通過(guò)免疫小鼠制備抗柴胡皂苷a的單克隆抗體,建立三萜皂苷類(lèi)化合物的免疫分析法,對(duì)柴胡皂苷a進(jìn)行定性和定量分析,為含柴胡皂苷a藥物及復(fù)方的質(zhì)量控制、體內(nèi)作用等研究提供一種技術(shù)手段。 方法： 利用高碘算鈉法氧化柴胡皂苷a,在堿性條件下與載體蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、多聚賴(lài)氨酸(PLL)偶聯(lián)成人工抗原�？疾旄鞣N影響人工抗原合成的條件。用紫外分光光度法、薄層色譜法和小鼠免疫反應(yīng)對(duì)合成的抗原進(jìn)行鑒定。 將柴胡皂苷a (SSa)、SSa-BSA、SSa-PLL、BSA、PLL用薄層色譜法進(jìn)行檢測(cè),用乙酸乙酯-甲醇-水(8：2：1)為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi),結(jié)束后晾干,用10%硫酸-乙醇溶液顯色。 用合成的人工抗原免疫Balb/C小鼠。按100μg/只的劑量取人工抗原,與等體積弗氏佐劑乳化均勻后皮下多點(diǎn)和腹腔注射,經(jīng)過(guò)初次免疫和4次加強(qiáng)免疫后,尾尖取血,間接ELISA檢測(cè)抗血清的效價(jià),評(píng)價(jià)人工抗原的免疫原性；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗血清的特異性。 取免疫小鼠的脾細(xì)胞,用PEG法與SP2/0細(xì)胞融合,最終獲得能穩(wěn)定分泌抗柴胡皂苷a抗體的雜交瘤細(xì)胞,采用腹水法大量制備抗柴胡皂苷a的單克隆抗體。 用生產(chǎn)的單克隆抗體建立柴胡皂苷a的免疫分析方法,檢測(cè)該抗體的特異性、敏感性以及與其他中藥活性成分的交叉反應(yīng)率。 結(jié)果： 通過(guò)上述方法,本實(shí)驗(yàn)合成了可用于免疫的柴胡皂苷a的人工抗原,經(jīng)鑒定,人工抗原偶聯(lián)成功。免疫小鼠后得到的抗血清,間接ELISA檢測(cè)效價(jià)最高達(dá)1：80000。通過(guò)細(xì)胞融合和篩選,得到了單克隆細(xì)胞株并進(jìn)行抗體的生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)單抗的鑒定,其檢測(cè)范圍為1μg/mL-500μg/mL。 結(jié)論： 在人工抗原的鑒定方面,薄層色譜法具有很好的優(yōu)勢(shì),操作簡(jiǎn)單,節(jié)省時(shí)間,檢測(cè)結(jié)果比較準(zhǔn)確。 利用柴胡皂苷a抗體建立的免疫分析方法可對(duì)含柴胡皂苷a的復(fù)方、湯劑等進(jìn)行定量檢測(cè)：還可以對(duì)血清、組織等生物樣品中的柴胡皂苷a進(jìn)行定性和定量分析,研究柴胡皂苷a在生物體內(nèi)的分布和作用。
【關(guān)鍵詞】：ELISA 柴胡皂苷a 單克隆抗體 人工抗原
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R284;R392
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 縮略語(yǔ)表12-14
• 文獻(xiàn)綜述14-26
• 1 柴胡與柴胡皂苷a14-15
• 1.1 柴胡14
• 1.2 柴胡皂苷a14-15
• 2 柴胡常用的分析檢測(cè)方法15
• 3 免疫分析方法15-26
• 3.1 人工抗原合成16-20
• 3.1.1 高碘酸鈉法17
• 3.1.2 碳二亞胺法17-18
• 3.1.3 混合酸酐法18-19
• 3.1.4 重氮化法19
• 3.1.5 活潑酯法19
• 3.1.6 戊二醛法19
• 3.1.7 其他方法19-20
• 3.2 免疫分析方法的應(yīng)用20-26
• 3.2.1 免疫親和色譜柱21-23
• 3.2.2 蛋白質(zhì)印記法23
• 3.2.3 膠體金法23-26
• 前言26-28
• 材料與方法28-42
• 1 實(shí)驗(yàn)材料28-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)耗材和試劑28-29
• 1.3 主要儀器29-31
• 1.4 常用溶液及培養(yǎng)基配置31-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-42
• 2.1 高碘酸鈉法合成SSa人工抗原33-34
• 2.2 SSa人工抗原的鑒定34-35
• 2.2.1 紫外掃描法34
• 2.2.2 薄層色譜法34-35
• 2.3 動(dòng)物免疫35
• 2.4 間接ELISA法測(cè)定血清中抗體的效價(jià)35-36
• 2.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗血清中抗體的特異性36
• 2.6 細(xì)胞融合36-37
• 2.7 雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化37-38
• 2.8 腹水誘導(dǎo)38
• 2.9 腹水純化及鑒定38-40
• 2.10 用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法繪制抑制率曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)40
• 2.11 交叉反應(yīng)40-42
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-52
• 1 人工抗原合成實(shí)驗(yàn)方案的優(yōu)化42
• 2 SSa-BSA的紫外檢測(cè)結(jié)果42-43
• 3 SSa-BSA和SSa-PLL的薄層色譜圖43-44
• 4 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-46
• 4.1 間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)44-45
• 4.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗血清中抗體的特異性45-46
• 5 柴胡皂苷a單抗制備結(jié)果46-52
• 5.1 細(xì)胞融合結(jié)果46
• 5.2 克隆化結(jié)果46-47
• 5.3 腹水誘導(dǎo)和純化結(jié)果47
• 5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法測(cè)定腹水的抑制率47-49
• 5.5 交叉反應(yīng)率結(jié)果49-52
• 討論52-58
• 1 人工抗原制備52-53
• 2 人工抗原的鑒定53-54
• 3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)54
• 4 單克隆抗體的制備54-55
• 5 腹水制備和純化55
• 6 單抗特異性鑒定55-56
• 7 應(yīng)用前景56
• 8 單克隆抗體在應(yīng)用時(shí)的注意事項(xiàng)56-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 致謝64-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：429296