發(fā)布時間：2017-06-06 14:02

  本文關(guān)鍵詞：CRISPR-Cas9系統(tǒng)定向編輯TCR基因的sgRNA篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：為構(gòu)建靶向T細(xì)胞抗原受體(T Cell Receptor,TCR)基因的CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng),基于p X458質(zhì)粒構(gòu)建靶向TCR基因β鏈C區(qū)的CRISPR-Cas-sgRNA質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞系,用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率;轉(zhuǎn)染48 h后提取Hep G2細(xì)胞基因組DNA,擴(kuò)增含有編輯位點的片段,測序分析該片段的峰圖改變;對出現(xiàn)雙峰的擴(kuò)增片段做T-A克隆后測序分析,確定基因編輯發(fā)生的位置,并結(jié)合轉(zhuǎn)染效率計算基因編輯效率.結(jié)果表明,成功構(gòu)建含有3種sgRNA序列(N1、N2、S1)的p X458-sgRNA質(zhì)粒,其轉(zhuǎn)染效率分別為38.5%(N1)、39.7%(N2)和24.2%(S1);基因組PCR產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn),S1組擴(kuò)增片段在打靶位置出現(xiàn)雜峰;T-A克隆測序發(fā)現(xiàn),20克隆有4個發(fā)生了基因編輯(20%),結(jié)合轉(zhuǎn)染效率(24.2%)可知,編輯效率約為83%.可見,本文成功構(gòu)建靶向TCR基因的CRISPR-CassgRNA質(zhì)粒,并鑒定出基因編輯效率較高的一種sgRNA序列.
【作者單位】： 廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院;廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室;廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【關(guān)鍵詞】： T細(xì)胞抗原受體 靶向 CRISPR 基因組 編輯
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(31100664,31300737,81303292)
【分類號】：R392
【正文快照】： 0引言T細(xì)胞抗原受體(T Cell Receptor,TCR)決定著T淋巴細(xì)胞的抗原識別特異性,在免疫識別中具有重要的靶向作用.將特定識別某種抗原的TCR基因轉(zhuǎn)入普通的T細(xì)胞,將能夠賦予細(xì)胞特定的抗原識別能力[1].Clay等人在黑色素瘤模型上進(jìn)行的相關(guān)研究首先表明了TCR基因改造T細(xì)胞的可行性[

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本文編號：426551