發(fā)布時(shí)間：2017-06-03 19:15

  本文關(guān)鍵詞：人活性顆粒酶K重組蛋白的制備及其促炎作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：顆粒酶(Granzyme)是NK細(xì)胞和CTLs在殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的一類絲氨酸蛋白酶。人顆粒酶包括顆粒酶A/B/K/M/H,各種顆粒酶通過作用于各自對應(yīng)底物發(fā)揮生物功能。顆粒酶K(GzmK)是類胰蛋白酶家族成員之一,它通過切割特異底物蛋白或蛋白復(fù)合物介導(dǎo)caspase非依賴細(xì)胞凋亡。最近幾年研究發(fā)現(xiàn),除了細(xì)胞毒性作用,GzmK在流感病毒感染小鼠體內(nèi)表達(dá)水平明顯上調(diào),表明其在機(jī)體抗病毒過程中具有重要作用。另外,在一些急性炎癥患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)顆粒酶K表達(dá)水平與急性炎癥的發(fā)展有關(guān),提示顆粒酶K可能參與炎癥反應(yīng),但其如何參與炎癥反應(yīng)及其機(jī)制尚不太明確。因此,利用基因工程方法制備人活性GzmK重組蛋白并進(jìn)一步研究其促炎作用機(jī)制具有重要意義。 首先,利用RT-PCR擴(kuò)增得到人活性顆粒酶K基因片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入到pET24a(+)載體質(zhì)粒中構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET24a(+)-GzmK。重組質(zhì)粒pET24a(+)-GzmK轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3并利用IPGT誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE和western blot進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明人活性GzmK重組蛋白已在大腸桿菌中成功地進(jìn)行了表達(dá)。 其次,對工程菌表達(dá)條件進(jìn)行初步優(yōu)化,在最優(yōu)條件下表達(dá)人活性GzmK重組蛋白,并利用Ni2+柱親和層析法對目的蛋白進(jìn)行了純化,其純度可達(dá)90%以上。獲得高純度人活性GzmK重組蛋白后,利用絲氨酸酶檢測試劑盒和westernblot分別對其酶活性進(jìn)行測定,結(jié)果表明該重組蛋白具有較好的生物學(xué)活性。重組蛋白中的內(nèi)毒素經(jīng)內(nèi)毒素吸收試劑盒去除。 最后,用人活性GzmK重組蛋白處理人單核細(xì)胞系THP-1,利用實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA分別從mRNA水平和蛋白水平檢測了THP-1分泌炎癥因子的情況,結(jié)果表明GzmK可促進(jìn)THP-1分泌炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-8、IL-1β,并且具有濃度依賴性。利用western blot檢測結(jié)果證明GzmK可能通過激活ERK1/2和p38MAPK信號通路促進(jìn)炎癥因子的分泌,且這種促炎作用可能是通過THP-1細(xì)胞上的蛋白酶激活受體1(PAR-1)介導(dǎo)的。 本研究利用基因工程的方法制備了具有生物學(xué)活性的人活性GzmK重組蛋白,并初步證明了GzmK可促進(jìn)THP-1細(xì)胞分泌炎癥因子及其可能的分子機(jī)制,該研究結(jié)果為闡明GzmK參與炎癥反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并進(jìn)而以顆粒酶K為靶向進(jìn)行抗炎癥治療奠定了一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：顆粒酶K 原核表達(dá) 活性測定 促炎作用
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-7
• Abstract7-10
• 前言10-22
• 第一章 人活性GzmK基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)22-40
• 引言22-23
• 材料23-29
• 方法29-36
• 結(jié)果36-39
• 討論39-40
• 第二章 人活性GzmK重組蛋白的純化及活性鑒定40-58
• 引言40
• 材料40-45
• 方法45-50
• 結(jié)果50-56
• 討論56-58
• 第三章 人活性GzmK重組蛋白促炎作用機(jī)制研究58-74
• 引言58
• 材料58-61
• 方法61-65
• 結(jié)果65-72
• 討論72-74
• 結(jié)論74-75
• 附錄75-76
• 參考文獻(xiàn)76-83
• 綜述83-92
• 參考文獻(xiàn)89-92
• 致謝92

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：人活性顆粒酶K重組蛋白的制備及其促炎作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：419002