發(fā)布時(shí)間：2017-06-02 16:10

  本文關(guān)鍵詞：登革病毒2型外膜E蛋白基因DⅢ區(qū)的表達(dá)及其在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：最近幾十年來(lái)，由于全球人口數(shù)量和流動(dòng)性持續(xù)增加，登革熱在全球的流行范圍不斷擴(kuò)大，并已成為目前世界上分布最廣、發(fā)病最多的蟲媒病毒病，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的威脅。由于缺乏疫苗，登革熱的防治一直是世界性難題。除了媒介控制外，感染者的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、隔離以及治療是目前預(yù)防登革熱進(jìn)一步擴(kuò)散的重要手段，因此，早期診斷對(duì)于登革熱的預(yù)防控制至關(guān)重要。 登革熱的早期診斷一直是登革熱防治研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)也在不斷發(fā)展，包括病毒核酸檢測(cè)、抗原抗體檢測(cè)在內(nèi)的多種實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)已被應(yīng)用于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)工作。目前，國(guó)外已經(jīng)有多家試劑公司研制成功并推出了包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、膠體金免疫層析法（ICT）等在內(nèi)的商品化病毒抗體檢測(cè)試劑盒，此類試劑盒具有快速、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，特別是基層實(shí)驗(yàn)室所采用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)雖然也有不少研究機(jī)構(gòu)開展登革病毒抗體檢測(cè)試劑盒的研制，并有相關(guān)研制的報(bào)道，但其實(shí)際應(yīng)用一直沒有取得突破，試劑的國(guó)產(chǎn)化一直是國(guó)內(nèi)登革熱防控工作的短板。 本課題以登革2型病毒外膜蛋白（envelope，E）為研究對(duì)象，，在其編碼基因的DⅢ區(qū)上下游各設(shè)計(jì)8條引物，分別引入Nde I和Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，交叉配對(duì)共擴(kuò)增出64條DⅢ區(qū)基因片段，利用pET30a(+)表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21（DE3）中分別克隆和表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證其表達(dá)含量及重組蛋白的免疫反應(yīng)性，篩選表達(dá)量大且有較強(qiáng)免疫反應(yīng)性的重組蛋白抗原進(jìn)行純化并建立間接ELISA法用以檢測(cè)登革熱IgM抗體，為國(guó)產(chǎn)試劑提供候選抗原和方法。 為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)建立的ELISA法檢測(cè)效果，我們以Panbio公司生產(chǎn)的登革熱IgM檢測(cè)試劑盒作為對(duì)照，選取112份臨床血清標(biāo)本進(jìn)行了初步的試劑評(píng)估。檢測(cè)結(jié)果表明，以IFA檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，本研究ELISA法檢測(cè)IgM的靈敏度為94.64%，特異度為91.07%；與Panbio公司生產(chǎn)試劑盒相比，本研究建立的ELISA法檢測(cè)登革病毒IgM抗體的檢測(cè)陽(yáng)性符合率為92.85%，陰性符合率為89.29%，總符合率為91.07%，Kappa值為0.8214，提示兩檢測(cè)方法具有較高的一致性，且兩種檢測(cè)方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ~2=0.3,P0.05）。提示本研究所建立的方法具有較好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 外膜E蛋白 DⅢ區(qū) 免疫反應(yīng)性 血清學(xué)診斷
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文縮寫詞9-11
• 第一部分 引言11-13
• 第二部分 材料與方法13-27
• 一、 材料13-15
• 1．病毒株及細(xì)胞株13
• 2．血清標(biāo)本13
• 3．質(zhì)粒和菌種13
• 4．細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑13
• 5．分子克隆所用的試劑13-14
• 6．蛋白表達(dá)與純化所用試劑14
• 7．抗體14
• 8．主要儀器和設(shè)備14-15
• 9．主要的生物軟件及分析工具15
• 二、 方法15-27
• 1． 病毒的增殖及間接免疫熒光法（IFA）驗(yàn)證病毒增殖情況15
• 2． 病毒 RNA 的提取15-16
• 3． Den2 E 基因片段的擴(kuò)增及 TA 克隆的構(gòu)建。16-19
• 4． Den2 E 基因 DⅢ區(qū)片段的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建19-22
• 5． BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞制備22-23
• 6． 重組蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)及免疫反應(yīng)性檢測(cè)23-24
• 7． 重組蛋白的大量表達(dá)與純化24-25
• 8． 重組蛋白抗原應(yīng)用于 ELISA 檢測(cè)25-26
• 9． IFA 檢測(cè)臨床標(biāo)本中抗體情況26
• 10． ELISA 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理26-27
• 第三部分 結(jié)果27-43
• 一、 病毒感染后的細(xì)胞形態(tài)變化及 IFA 檢測(cè)結(jié)果27-28
• 二、 Den2 全長(zhǎng) E 基因片段的擴(kuò)增、TA 克隆及序列分析28-29
• 1． Den2 全長(zhǎng) E 基因片段的擴(kuò)增結(jié)果28
• 2． Den2E TA 克隆的酶切鑒定及序列分析28-29
• 三、 E 基因 DⅢ區(qū)的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建29-32
• 1． Den2 E 基因 DⅢ區(qū)的擴(kuò)增29-31
• 2． DⅢ區(qū)重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定31-32
• 四、 重組質(zhì)粒的小量誘導(dǎo)表達(dá)與免疫反應(yīng)性鑒定32-34
• 1． 重組質(zhì)粒的小量誘導(dǎo)表達(dá)32-33
• 2． 重組蛋白 Western blot 鑒定免疫反應(yīng)性。33-34
• 五、 重組蛋白的大量表達(dá)與純化34-37
• 1． 重組蛋白的大量表達(dá)及包涵體的洗滌34-35
• 2． 重組蛋白的純化35-36
• 3． 純化后重組蛋白的免疫反應(yīng)性鑒定36-37
• 六、 重組蛋白 F4R1 間接 ELISA 法檢測(cè)臨床血清 IgM 抗體37-43
• 1． 本研究重組蛋白間接 ELISA 法檢測(cè)臨床血清 IgM 抗體結(jié)果37-41
• 2． 本研究重組蛋白間接 ELISA 法檢測(cè)臨床血清 IgM 抗體結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析41-42
• 3． 型別交叉反應(yīng)42-43
• 第四部分 討論43-47
• 第五部分 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 致謝50-51
• 綜述51-58
• 參考文獻(xiàn)55-58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 田秀君;趙高潮;烏姍娜;谷俊朝;;登革疫苗研究進(jìn)展[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2010年12期

  本文關(guān)鍵詞：登革病毒2型外膜E蛋白基因DⅢ區(qū)的表達(dá)及其在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：415817