本文關鍵詞：人4-1BBL在K562細胞中的表達研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：4-1BBL（CD137L）為Ⅱ型跨膜糖蛋白分子，屬于腫瘤壞死因子（tumornecrosis factor，TNF）超家族。4-1BBL與其受體4-1BB結合形成4-1BB/4-1BBL復合物，作為一對重要的共刺激分子，廣泛參與多種免疫細胞的激活。在細胞免疫過程中，T細胞增殖分化成效應細胞時，一方面需要抗原肽-MHC復合物介導的特異性的刺激，另一方面需要有協(xié)同刺激分子提供的第二信號。缺乏協(xié)同刺激分子提供第二信號，T細胞將進入無反應狀態(tài)甚至調亡。因此，協(xié)同刺激分子提供的第二信號對于T細胞介導的細胞免疫應答不可或缺。4-1BBL是已知的協(xié)同刺激因子之一，對其進一步的研究對于了解協(xié)同刺激分子在細胞免疫中的作用有重要意義。 MICA是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白，作為配體與其受體NKG2D結合在機體自然免疫中對NK細胞的激活起重要作用。NK細胞表面存在兩種受體：殺傷細胞抑制性受體和殺傷細胞活化性受體。抑制性受體特異性識別細胞表面MHCⅠ類分子并使得正常的細胞免遭NK細胞的殺傷；NK細胞的活化性受體識別經(jīng)典、非經(jīng)典MHCⅠ類蛋白分子或MHCⅠ類相關蛋白分子，在NK細胞的活化的啟動方面起關鍵作用。NKG2D是NK細胞重要的活化受體之一，其配基有非經(jīng)典的MHCⅠ類分子蛋白A (MHC classⅠchain-related A，MICA)、 MHCⅠ類分子蛋白B(MHC classⅠ chain related B，MICB)。MICA存在于幾乎所有人類上皮源性腫瘤中，MICA與其受體NKG2D的結合對于NK細胞殺傷腫瘤細胞起重要的作用。 克隆并構建人4-1BBL和MICA真核表達質粒并進行K562細胞的轉染，對于進一步研究協(xié)同刺激分子在T細胞免疫中的作用機理和NK細胞激活中的免疫機制具有重要的理論意義，，對結合適應性免疫系統(tǒng)中T細胞免疫和天然免疫系統(tǒng)中NK細胞在抗病毒感染、抗腫瘤免疫治療中有重要的指導價值。 本研究主要進行以下三方面的工作： 1重組人MICA真核表達質粒的構建 分離人外周血單個核細胞為材料，提取總RNA為模版進行RT-PCR獲得人MICA基因，將其連接到真核表達載體pcDNA3.1/Hygro中，構建重組真核表達質粒pcDNA3.1/Hygro-hMICA。對重組真核表達質粒測序結果進行鑒定。 2人4-1BBL真核表達載體的構建 以pORF-h4-1BBL v16為模版進行PCR獲得人4-1BBL基因，將其導入雙表達真核表達載體pVITRO2-neo-mcs中，構建重組真核表達質粒pVITRO-h4-1BBL。 3將成功構建的重組人真核表達質粒pVITRO2-h4-1BBL用脂質體介導的方式轉染到K562細胞內(nèi)。有限稀釋法篩選陽性單克隆。流式細胞術鑒定表達4-1BBL的重組K562細胞單克隆。 綜上，本實驗成功構建了人真核表達質粒pcDNA3.1/Hygro-MICA和人真核表達質粒pVITRO2-h4-1BBL，并將重組真核表達質粒pVITRO2-h4-1BBL轉染K562細胞，獲得表達4-1BBL蛋白的重組K562細胞單克隆。
【關鍵詞】：4-1BBL MICA K562 轉染
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：Q78;R392.12
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-21
• 1.1 MICA 的概述12-15
• 1.1.1 MICA 的基因結構13
• 1.1.2 MICA 分子的表達調控13-14
• 1.1.3 MICA 的功能14
• 1.1.4 MICA 與腫瘤的關系14-15
• 1.2 4-1BBL 概述15-20
• 1.2.1 4-1BBL 的生物學特性15
• 1.2.2 4-1BBL 分子的表達15-16
• 1.2.3 4-1BBL/4-1BB 的信號傳導特性16-17
• 1.2.4 4-1BBL/4-1BB 與免疫細胞的關系17-19
• 1.2.5 4-1BBL 與腫瘤細胞的關系19-20
• 1.3 立題依據(jù)20-21
• 第2章 hMICA 基因表達載體的構建21-32
• 2.1 材料和方法21-27
• 2.1.1 材料21-23
• 2.1.2 方法23-27
• 2.2 結果27-31
• 2.3 討論31-32
• 第3章 4-1BBL 基因表達載體的構建/轉染及表達鑒定32-45
• 3.1 材料和方法32-38
• 3.1.1 材料32-34
• 3.1.2 方法34-38
• 3.2 結果38-42
• 3.2.1 PCR 獲取目的基因38-39
• 3.2.2 PMD18-T-h4-1BBL 克隆的構建及鑒定39
• 3.2.3 pVITRO-h4-1BBL 真核表達質粒的構建及鑒定39-41
• 3.2.4 G418 最佳篩選濃度的選擇41
• 3.2.5 陽性轉染細胞的鑒定41-42
• 3.3 討論42-45
• 3.3.1 表達細胞的選擇43
• 3.3.2 表達質粒的選擇43
• 3.3.3 人工脂質體轉染的優(yōu)點43-44
• 3.3.4 陽性轉染細胞的篩選44-45
• 第4章 研究總結45-46
• 4.1 本研究的實驗結果45
• 4.2 擬進一步的研究方案45-46
• 參考文獻46-50
• 致謝50

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 孫琳琳;劉利民;孫學科;周剛;趙金玲;;MIC基因的研究進展[J];免疫學雜志;2006年S1期

2 王群,張利寧,肖東杰,丁培芳,宋靜,孫汶生;人外周血樹突狀細胞的體外誘導培養(yǎng)及其表面CD137、CD137L的表達特點[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2003年04期

3 張錦英;居頌文;;CD137L分子在人肺癌細胞系A549上的表達及其生物學功能的研究[J];中國血液流變學雜志;2007年03期

4 張彩,馮進波,王郡甫,許曉群,張建,田志剛;膜型分泌型MICA對NK細胞受體NKG2D的相反調節(jié)效應及其對NK細胞受體譜的影響[J];中華微生物學和免疫學雜志;2004年02期

5 齊錦,彭萍,戴夢華,李勇海,崔蓮仙,何維;MICA反應性Vδ1γδT細胞對上皮腫瘤細胞的細胞毒作用[J];中國醫(yī)學科學院學報;2004年01期

  本文關鍵詞：人4-1BBL在K562細胞中的表達研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：412937