本文關(guān)鍵詞：SPIO及LV-GFP對(duì)TSCs標(biāo)記的有效性和安全性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 肌腱干細(xì)胞（TSCs）是來(lái)源于肌腱組織的一種具有高度增殖潛能、正常情況下分化為肌腱細(xì)胞的一種前體細(xì)胞，2007年Bi等首次從兔肌腱內(nèi)分離，并證實(shí)TSCs具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化潛能，大量研究表明外源性TSCs有可能成為肌腱損傷和肌腱病細(xì)胞治療的重要手段。TSCs在體外的生物學(xué)行為變化及在體內(nèi)的定植和遷移變化是TSCs相關(guān)研究的核心問(wèn)題之一；有效、安全的標(biāo)記方法對(duì)所移植的TSCs進(jìn)行示蹤對(duì)其相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究至關(guān)重要。 國(guó)外有關(guān)TSCs的研究均集中于其分子生物學(xué)特性的相關(guān)研究，而對(duì)于其體內(nèi)移植的示蹤及觀察等臨床應(yīng)用研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。目前干細(xì)胞標(biāo)記方法較多，均存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)，SPIO、LV-GFP標(biāo)記技術(shù)可能適合于TSCs的體內(nèi)外標(biāo)記示蹤。結(jié)合SPIO可活體、無(wú)創(chuàng)示蹤，適用于臨床推廣的優(yōu)點(diǎn)，以及慢病毒（LV，Lentivirus）介導(dǎo)的GFP轉(zhuǎn)染示蹤操作簡(jiǎn)便、成本低廉、熒光表達(dá)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，本課題擬對(duì)SPIO、LV-GFP標(biāo)記TSCs方法的有效性、安全性進(jìn)行探討。 目的： 1.在文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)上，改進(jìn)TSCs酶消化法，建立穩(wěn)定高效的TSCs分離、獲取方法； 2.探索SPIO及LV-GFP兩種細(xì)胞示蹤標(biāo)記方法合適的標(biāo)記條件，分析它們對(duì)TSCs標(biāo)記的有效性和安全性，及其對(duì)TSCs生物學(xué)特性的影響； 3.觀察上述方法在體內(nèi)標(biāo)記、示蹤的有效性； 通過(guò)本課題研究，擬為T(mén)SCs的體內(nèi)外示蹤提供有效和安全的技術(shù)方法和理論支持。 方法： 1.在國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，將傳統(tǒng)酶消化-過(guò)濾法予以改進(jìn)，不過(guò)濾而直接種植來(lái)分離、培養(yǎng)大鼠TSCs，并利用流式分析、免疫熒光、多向誘導(dǎo)分化等手段對(duì)該法獲取的TSCs進(jìn)行鑒定。 2.采用葡聚糖包裹的SPIO和慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白兩種標(biāo)記手段對(duì)TSCs進(jìn)行標(biāo)記，觀察SPIO濃度對(duì)TSCs標(biāo)記有效率、體外標(biāo)記后MRI檢測(cè)效率及其對(duì)TSCs的生長(zhǎng)曲線的影響； 3.摸索不同MOI值Lv-GFP對(duì)TSCs標(biāo)記的有效率、體外標(biāo)記傳代衰減情況、檢測(cè)其對(duì)TSCs干性的影響，選擇合最佳的MOI值。 4.建立大鼠跟腱急性斷裂模型，將示蹤標(biāo)記的TSCs在損傷部位注射，，于損傷早期（1周）及瘢痕重建后（6周）取材，觀察經(jīng)標(biāo)記的TSCs在急性跟腱斷裂模型中的遷移、定植情況，證實(shí)該示蹤方法的有效性。 結(jié)果： 1.通過(guò)我們改進(jìn)的TSCs酶消化法，一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物即可獲取4瓶原代細(xì)胞，較傳統(tǒng)酶消化-過(guò)濾法，該法可多量、更穩(wěn)定的獲取原代細(xì)胞；該法提取的TSCs形態(tài)、克隆形成能力及增殖能力符合干細(xì)胞特征；Ⅰ型膠原、胚胎表面抗原SSEA4、Oct4表達(dá)陽(yáng)性，Ⅲ型膠原表達(dá)陰性；干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、CD44呈陽(yáng)性表達(dá)；CD34、CD106呈陰性表達(dá)；在體外誘導(dǎo)的情況下TSCs具有明確的成脂、成骨和成軟骨分化能力。 2.葡聚糖包裹的SPIO能夠標(biāo)記TSCs，標(biāo)記有效率隨SPIO濃度增大而增加，作用濃度達(dá)到8ug/ml時(shí)標(biāo)記效率95%，細(xì)胞內(nèi)能夠有效觀察到鐵顆粒吞噬，但其對(duì)TSCs的增殖影響很大。 3. LV-GFP在體外能夠有效標(biāo)記TSCs，標(biāo)記有效率隨感染復(fù)數(shù)（MOI值）增加而增加，最佳MOI值為500，熒光強(qiáng)度值不隨體外傳代而減低，對(duì)成脂、成骨、成軟骨相關(guān)基因無(wú)明顯影響。 4.外源性TSCs經(jīng)過(guò)LV-GFP標(biāo)記后，能夠在異體正常肌腱內(nèi)隨肌腱纖維的走行定植，在急性跟腱斷裂模型中定植于斷裂部位及形成的瘢痕中，超過(guò)6周仍能有效觀察。 結(jié)論： 1.經(jīng)過(guò)我們改進(jìn)的酶消化法分離、培養(yǎng)大鼠跟腱來(lái)源TSCs可靠、有效，能夠更多且穩(wěn)定的獲取TSCs；經(jīng)鑒定，該方法提取的TSCs具有明確的干細(xì)胞特性，有多向分化潛能。 2.葡聚糖包裹的SPIO雖然能夠可靠標(biāo)記大鼠TSCs，但對(duì)其增殖能力影響過(guò)大，可能不適用于TSCs的標(biāo)記示蹤，其他劑型的SPIO對(duì)TSCs標(biāo)記特性仍有待進(jìn)一步研究。 3.慢病毒介導(dǎo)的GFP在體外對(duì)TSCs示蹤標(biāo)記有效可靠，標(biāo)記有效率不隨長(zhǎng)期傳代而降低，對(duì)其干性無(wú)明確影響，是一種針對(duì)TSCs的可靠有效的示蹤標(biāo)記物。 4.外源性TSCs經(jīng)過(guò)LV-GFP標(biāo)記后，能夠觀察到其大鼠跟腱內(nèi)的定植和遷移，LV-GFP在體內(nèi)也能夠有效標(biāo)記并示蹤TSCs，對(duì)TSCs是一種有效的標(biāo)記示蹤方法。
【關(guān)鍵詞】：肌腱干細(xì)胞 SPIO LV-GFP 細(xì)胞示蹤
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 英文摘要7-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 1.1 研究背景11-12
• 1.2 研究意義12
• 1.3 研究?jī)?nèi)容12
• 1.4 研究方法12-13
• 第二章 大鼠跟腱來(lái)源肌腱干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定13-25
• 2.1 引言13
• 2.2 材料與方法13-18
• 2.3 結(jié)果18-23
• 2.4 討論23-24
• 2.5 小結(jié)24-25
• 第三章 SPIO 對(duì)體外 TSCs 標(biāo)記的有效性及對(duì)其生物活性的影響25-38
• 3.1 引言25
• 3.2 材料與方法25-29
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-36
• 3.4 討論36-37
• 3.5 小結(jié)37-38
• 第四章 LV-GFP 對(duì)體外 TSCs 標(biāo)記的有效性及對(duì)其生物活性的影響38-50
• 4.1 引言38
• 4.2 材料與方法38-43
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-48
• 4.4 討論48-49
• 4.5 小結(jié)49-50
• 第五章 Lv-GFP 標(biāo)記 TSCs 在大鼠跟腱修復(fù)過(guò)程的有效性分析50-59
• 5.1 引言50
• 5.2 材料與方法50-53
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-57
• 5.4 討論57
• 5.5 小結(jié)57-59
• 全文結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 文獻(xiàn)綜述65-72
• 參考文獻(xiàn)70-72
• 碩士期間發(fā)表和待發(fā)表的文章72-73
• 致謝73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：SPIO及LV-GFP對(duì)TSCs標(biāo)記的有效性和安全性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：412360