本文關(guān)鍵詞：鈣離子結(jié)合蛋白S100A4的原核表達純化以及S100A6單克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝臟是人體最大的消化器官，主要負責維持新陳代謝的正常進行。由于肝臟參與食物消化這一特殊功能，使其極易發(fā)生病變，引起包括急性肝衰和肝臟纖維化等發(fā)病率和死亡率都較高的疾病的發(fā)生，從而引起人們的重視。 通過CCl4誘導的小鼠急慢性肝損傷模型和基因芯片等技術(shù)手段，我們深入探討了肝臟損傷修復的原理和機制，從而獲得治療肝損傷的全新思路和藥物靶點。其中S100家族隨著肝臟損傷修復過程呈現(xiàn)的規(guī)律性的表達變化，使其成為我們的重點研究對象。 本論文以S100家族為切入點，主要包括兩部分的研究內(nèi)容：重組人S100A4的原核表達純化及活性測定和S100A6單克隆抗體的制備。 S100A4是S100蛋白家族的成員，在細胞的增殖，分化，損傷修復以及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究將S100A4全長基因構(gòu)建到pET28a原核表達載體上，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達和純化出高純度的重組人S100A4。通過試驗證明，重組人S100A4蛋白在體外可以有效的增強黑色素瘤細胞A375-S2的增殖。重組人S100A4原核表達與純化方法的建立將促進其結(jié)構(gòu)和生物學功能研究，并且對于S100蛋白家族其他蛋白的表達與純化具有重要的參考意義。并且可用于后期對肝臟纖維化模型的藥效和藥理研究。 為了制備抗人S100A6的單克隆抗體，利用原核表達純化后所得純度97%的hS100A6為抗原，與弗氏佐劑相結(jié)合免疫Balb/c小鼠。利用雜交瘤技術(shù)，處死免疫小鼠，取脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合，利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤。采用Elisa檢測，并用有限稀釋法篩選出分泌特異抗人S100A6抗體的雜交瘤細胞株。腹腔注射同種小鼠誘導腹水產(chǎn)生,并應用Protein G親和層析法進行抗體純化。采用單克隆抗體可變區(qū)VH和VL基因組測序，為抗體可變區(qū)分區(qū)；通過Elisa、WesternBlot鑒定該單克隆抗體。結(jié)果獲得2株可穩(wěn)定分泌小鼠抗人S100A6的單克隆抗體，分別命名為5-1G，8-6G。Elisa和Western Blot分析表明該2株單抗均能特異性識別hS100A6。最終成功制備了2株鼠抗人S100A6蛋白的單克隆抗體，，為建立S100A6蛋白檢測奠定了基礎(chǔ)。并且可用于后續(xù)S100A6中和抗體調(diào)節(jié)肝臟纖維化的藥理學研究。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 S100家族 S100A4 原核表達純化 單克隆抗體
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 目錄10-12
• 縮略詞中英文對照12-13
• 第一章 緒論13-22
• 1 肝臟病變的研究現(xiàn)狀13-15
• 1.1 急性肝衰竭13-14
• 1.2 肝臟纖維化14-15
• 2 鈣離子結(jié)合蛋白 S100 家族研究進展15-17
• 2.1 S100A4 研究現(xiàn)狀15-16
• 2.2 S100A6 研究現(xiàn)狀16-17
• 3 基因芯片在肝臟損傷模型上的應用17-20
• 3.1 四氯化碳誘導急性肝損傷模型基因芯片結(jié)果18-19
• 3.2 四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型基因芯片結(jié)果19-20
• 4 立題依據(jù)和研究內(nèi)容20-22
• 4.1 立題依據(jù)20-21
• 4.2 研究內(nèi)容21-22
• 第二章 重組人 S100A4 蛋白的表達與純化22-55
• 1 引言22-23
• 2 材料與方法23-43
• 2.1 儀器與設(shè)備23-25
• 2.2 實驗材料和試劑25-26
• 2.3 常用溶液的配制26-29
• 2.4 實驗方法29-36
• 2.5 重組 S100A4 的表達和純化36-40
• 2.6 SDS-PAGE 和 Western blot 檢測40-41
• 2.7 S100A4 內(nèi)毒素含量測定41
• 2.8 Bradford 法測 S100A4 蛋白溶液濃度41-42
• 2.9 S100A4 蛋白活性的測定42-43
• 3 實驗結(jié)果43-52
• 3.1 重組人 S100A4 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建43-47
• 3.2 rhS100A4 重組蛋白的原核表達和純化47-51
• 3.3 rhS100A4 重組蛋白的質(zhì)量檢測51-52
• 4 討論52-55
• 第三章 S100A6 單克隆抗體的制備55-92
• 1 引言55-57
• 2 材料與方法57-77
• 2.1 儀器與設(shè)備57-58
• 2.2 實驗材料和試劑58-59
• 2.3 主要溶液配制59-63
• 2.4 hS100A6 免疫 Balb/c 小鼠63-65
• 2.5 PEG 介導的小鼠脾臟和小鼠骨髓瘤細胞融合與雜交瘤篩選65-68
• 2.6 有限稀釋法篩選穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞68
• 2.7 Anti-hS100A6 單鏈抗體的構(gòu)建68-74
• 2.8 雜交瘤細胞產(chǎn)生同種小鼠腹水的制備74-75
• 2.9 Hi Trap Protein G 預裝柱純化腹水中 S100A6 單抗75-77
• 3 實驗結(jié)果77-88
• 3.1 hS100A6 免疫 Balb/c 小鼠77-78
• 3.2 抗原最佳包被量的檢測78-79
• 3.3 有限稀釋法篩選穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株79-82
• 3.4 抗體可變區(qū)的測序82-85
• 3.5 Anti-rhS100A6 抗體純化以及檢測85-88
• 4 討論88-92
• 第四章 結(jié)論和展望92-94
• 1. 結(jié)論92
• 2. 展望92-94
• 參考文獻94-101
• 附錄101-104
• 致謝104-106
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文106

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳善華;;用于診斷試驗和親和層析的單克隆抗體;抗體工程的初步階段[J];國際生物制品學雜志;1983年03期

2 閆燕華;;分泌抗HTG(人甲狀腺球蛋白)單克隆抗體的雜交瘤細胞系[J];現(xiàn)代免疫學;1985年03期

3 蔣性凡;周繼文;黃翠英;任繼明;楊守純;;鼠單克隆抗HBc檢測病人血清抗HBc應用的研究[J];現(xiàn)代免疫學;1985年03期

4 林漓;;用單克隆抗體成像法檢測血管栓塞[J];國外醫(yī)學情報;1985年02期

5 韓榮興;人肝細胞癌單克隆抗體的制備及其應用[J];細胞與分子免疫學雜志;1986年04期

6 白炎;用單克隆抗體來研究T細胞受體結(jié)構(gòu)及激活途徑(文獻綜述)[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;1986年01期

7 Berndt MC;杜曉平;Berndt C;阮長耿;;免疫沉淀法鑒定抗人血小板單克隆抗體識別的抗原[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);1986年03期

8 江慶平;;抗體結(jié)合氨甲喋呤試治腫瘤[J];國外醫(yī)學情報;1986年14期

9 劉爾翔;李文淥;劉寶豐;樊汝恭;毛映紅;;三株抗惡性瘧單克隆抗體(M26-32,F5-3F9,F5-4E9)的鑒定[J];生物工程學報;1986年01期

10 樊代明,張學庸,陳希陶,牟震先,胡家露,喬太東,陳寶軍;抗胃癌人、鼠單克隆抗體系列的研制及其臨床應用的綜合研究[J];細胞與分子免疫學雜志;1987年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐爽;徐焱;;單克隆抗體在輸血領(lǐng)域的應用探討[A];中國輸血1999年年會暨紀念ABO血型發(fā)現(xiàn)100周年學術(shù)交流論文專輯[C];1999年

2 李安民;;單克隆抗體標載的~(131)I治療惡性腦膠質(zhì)瘤Ⅱ期臨床試驗的三種給藥途徑的研究[A];第一屆中國腫瘤靶向治療技術(shù)大會論文集[C];2003年

3 于翠;施曼鈴;王桂珍;吳建祥;周雪平;;幾種重要植物病毒單克隆抗體的制備和快速檢測方法的建立[A];第三次全國植物病毒和病毒防治學術(shù)研討會論文集[C];2003年

4 劉振勇;鄧國華;李呈軍;張立春;田國彬;何后軍;于康震;陳化蘭;;抗禽流感H9N2亞型血凝素特異性單克隆抗體的制備與分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第六次研討會論文集[C];2005年

5 李振宇;趙益明;董寧征;沈飛;阮長耿;;抗FⅧ-C2區(qū)單克隆抗體的制備及鑒定[A];第11次中國實驗血液學會議論文匯編[C];2007年

6 張改連;黃烽;;抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體rituximab治療類風濕關(guān)節(jié)炎的臨床研究[A];第十二屆全國風濕病學學術(shù)會議論文集[C];2007年

7 郝波;張國新;林艷;楊楊;王宏娣;;抗HCCR單克隆抗體的制備及其在肝癌檢測中的初步應用[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

8 陶薇;楊連華;何卓晶;洪艷;陳勇;;抗戊型肝炎病毒重組蛋白單克隆抗體的制備和鑒定[A];浙江省醫(yī)學會醫(yī)學微生物與免疫學及醫(yī)學病毒學學術(shù)年會論文匯編[C];2009年

9 馬翠卿;郭奕陽;顧海燕;曾瑞紅;楊麗娟;魏林;;一株抗A族鏈球菌表面蛋白Fba的單克隆抗體對應的表位與Fba結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白FH的位點重疊[A];河北省免疫學會第六次免疫學大會資料匯編[C];2010年

10 楊天兵;沈倍奮;;抗人重組白細胞介素1(rHIL-1)單克隆抗體的研制[A];中國細胞生物學學會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賈超時邋李德成;單克隆抗體產(chǎn)業(yè)研發(fā)項目將落戶大慶[N];大慶日報;2008年

2 小許;市領(lǐng)導會見美國生物醫(yī)藥巨頭[N];無錫日報;2010年

3 姜海;英科學家發(fā)現(xiàn)單克隆抗體[N];科技日報;2007年

4 本報特約撰稿人 李朝;單抗：生物醫(yī)藥發(fā)展的主旋律[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

5 記者 項錚;賽諾菲巴斯德研制抗狂犬病單克隆抗體[N];科技日報;2008年

6 記者 楊俊堅;單抗藥物：站在同一起跑線[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2011年

7 張蕾;治療用單克隆抗體[N];光明日報;2002年

8 李曉;“蘇州系列”單克隆抗體走向世界[N];蘇州日報;2008年

9 張驍束;梅英;單克隆抗體的研究進展[N];中國醫(yī)藥報;2003年

10 鄒平;單克隆抗體研究取得突破[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 唐琳;肝再生增強因子與肝癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2005年

2 侯桂華;巨噬細胞移動抑制因子在同種移植排斥中作用及其機理的研究[D];山東大學;2004年

3 高勇;新型單克隆抗體熒光探針染料的合成及免疫熒光組織化學應用[D];西北大學;2006年

4 江敏;大鼠單克隆抗體的制備、鑒定、基因克隆、抗原分析以及藥物偶聯(lián)物的抗腫瘤作用研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;1996年

5 秦迎松;人促血液血管細胞生成素（Haemangiopoietin, HAPO）單克隆抗體的制備、鑒定及應用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2004年

6 萬忠海;抗PEA單抗和單鏈抗體制備及在綠膿感染中的應用[D];吉林大學;2008年

7 呂大偉;抗RANKL單克隆抗體在大鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎模型中的應用及RANKL轉(zhuǎn)錄調(diào)控的探索性研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2011年

8 莊國洪;抗DR4、DR5單克隆抗體誘導膠質(zhì)瘤細胞株凋亡的研究[D];吉林大學;2004年

9 付建芳;溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2005年

10 王曉潔;對蝦白斑癥病毒快速檢測試劑盒的研制及其應用[D];中國海洋大學;2005年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃子逸;LIGHT基因轉(zhuǎn)染細胞株和單克隆抗體的研制及其對T細胞的共刺激效應[D];蘇州大學;2010年

2 李鐵民;抗P-選擇素單克隆抗體對大鼠胰腺缺血再灌注損傷的作用實驗研究[D];中國醫(yī)科大學;2003年

3 李曉龍;肝癌相關(guān)抗原SMP30 mRNA在癌細胞中的表達及其單克隆抗體的制備[D];廣西醫(yī)科大學;2010年

4 鄭杰;分泌抗豬流感病毒（河南株）單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備、鑒定和初步應用[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2004年

5 邵煒慧;鹽酸克倫特羅單克隆抗體的研制及初步應用[D];揚州大學;2005年

6 楊寧;納豆激酶的純化及其單克隆抗體的制備鑒定[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2005年

7 唐琦;抗麻痹性貝毒素GTX2，3單克隆抗體的制備及特性分析[D];暨南大學;2005年

8 賈娟娟;抗胰島素單克隆抗體的研制及酶聯(lián)免疫分析方法的建立[D];中國原子能科學研究院;2005年

9 李彬;TLR4單克隆抗體誘導同種心臟移植免疫耐受的研究[D];蘇州大學;2010年

10 王雨晨;伏馬毒素B_1單克隆抗體的制備及多種免疫學檢測方法的建立[D];上海交通大學;2011年

  本文關(guān)鍵詞：鈣離子結(jié)合蛋白S100A4的原核表達純化以及S100A6單克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：411087