本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對不同線性增加的流體剪應(yīng)力的響應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究以SD大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）為研究對象，通過平板流動(dòng)腔裝置施加流體剪應(yīng)力，從細(xì)胞早期的力學(xué)敏感性響應(yīng)指標(biāo)，即細(xì)胞內(nèi)鈣離子[Ca2+]i響應(yīng)水平、一氧化氮（NO）的釋放量以及細(xì)胞骨架中微絲（F-actin）的重排情況來考察BMSCs對不同線性增加的流體剪應(yīng)力刺激的力學(xué)敏感性響應(yīng)；從細(xì)胞骨向分化標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）和軟骨向分化標(biāo)志物糖苷聚糖（GAG）的表達(dá)水平，研究不同線性增加的流體剪應(yīng)力刺激對BMSC分化的影響；考察不同線性增加的流體剪應(yīng)力對BMSCs的力學(xué)敏感型鈣離子通道開放的貢獻(xiàn)，以及力學(xué)敏感型鈣離子通道對細(xì)胞力學(xué)敏感性的影響。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 采用全骨髓懸液直接貼壁的方法獲取6周齡SD大鼠BMSCs，細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，用于實(shí)驗(yàn)的為第三、四代細(xì)胞。運(yùn)用本課題組設(shè)計(jì)的平板流動(dòng)腔裝置分別對BMSCs施加三種不同線性增加的流體剪應(yīng)力20分鐘,即0分鐘從0dyn/cm2線性增加到10dyn/cm2、2分鐘從0dyn/cm2線性增加到10dyn/cm2、20分鐘從0dyn/cm2線性增加到10dyn/cm2（分別簡化為0-0’、0-2’、0-20’）。采用流體剪應(yīng)力加載下實(shí)時(shí)觀測細(xì)胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)的成像技術(shù)手段，記錄BMSCs對三種加載方式的胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)情況；對0-0’、0-2’、0-20’三種加載方式分別作用于BMSCs20分鐘后細(xì)胞中連續(xù)F-actin的密度進(jìn)行定量分析；以及對三種加載方式分別作用于BMSCs1小時(shí)的過程中，系統(tǒng)內(nèi)NO的濃度變化進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0-2’的加載方式刺激BMSCs的胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)水平、胞內(nèi)連續(xù)F-actin聚合程度以及NO釋放量最大，其次是0-0’，最后是0-20’。將細(xì)胞在0-2’、0-20’兩種加載方式作用下出現(xiàn)第一個(gè)鈣峰時(shí)對應(yīng)的流體剪應(yīng)力，即1dyn/cm2、0.1dyn/cm2分別作用于BMSCs20分鐘并實(shí)時(shí)觀測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的響應(yīng)情況。進(jìn)行比較得到，，仍然是0-2’加載方式作用下BMSCs胞內(nèi)鈣離子的響應(yīng)水平最大，呈現(xiàn)0-2’＞0-0’＞0-20’＞1dyn/cm2＞0.1dyn/cm2的現(xiàn)象。這意味著BMSCs能夠識(shí)別不同線性增加的流體剪應(yīng)力，并且對三種不同的加載方式表現(xiàn)出不同的力學(xué)敏感性響應(yīng)，加載方式對細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)是有貢獻(xiàn)的。 為進(jìn)一步探究0-0’、0-2’、0-20’三種加載方式對BMSC分化的影響，分別對細(xì)胞進(jìn)行三種方式的力學(xué)刺激20分鐘后靜置培養(yǎng)48小時(shí)，隨后檢測細(xì)胞中堿性磷酸酶（ALP）和糖胺聚糖（GAG）的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)，0-2’加載方式后BMSCs中ALP含量最高，其次是0-20’，最后是0-0’；而GAG的結(jié)果則相反，0-0’加載方式后BMSCs的GAG含量最高，其次是0-20’，最后是0-2’。表明，0-2’加載方式有利于BMSC骨向分化，0-0’加載方式有利于BMSCs軟骨向分化。 在發(fā)現(xiàn)以上現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，我們從細(xì)胞力學(xué)敏感型鈣離子通道的角度出發(fā)，探索是否由于0-0’、0-2’、0-20’三種加載方式對BMSCs的力學(xué)敏感型鈣離子通道的影響不同，進(jìn)而影響了BMSCs的力學(xué)敏感性。利用力學(xué)敏感型鈣離子通道阻滯劑（Gadolinium，GdCl3）對BMSCs進(jìn)行預(yù)處理，同樣觀測了三種加載方式分別作用于BMSCs20分鐘的細(xì)胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)水平以及20分鐘后胞內(nèi)連續(xù)F-actin的聚合程度，發(fā)現(xiàn)，0-0’加載方式下細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)水平和胞內(nèi)連續(xù)F-actin的聚合程度最高，其次是0-2’，最后是0-20’，但是都沒有顯著性差異。 BMSCs受力刺激20分鐘再靜置培養(yǎng)48小時(shí)后0-2’的GAG的表達(dá)相對最高，其次是0-0’,最次是0-20’，并沒有顯著性差異；而0-0’的ALP的表達(dá)相對最高，其次是0-2’,最次是0-20’，彼此也沒有顯著性差異。表明，力學(xué)敏感型鈣離子通道被阻斷后，BMSCs對不同線性增加的流體剪應(yīng)力不表現(xiàn)差異性響應(yīng)。力學(xué)敏感型鈣離子通道調(diào)控了BMSC對不同線性增加流體剪應(yīng)力刺激的力學(xué)敏感性。 研究結(jié)果顯示，BMSCs流體剪應(yīng)力刺激具有高度敏感性，力學(xué)敏感型鈣離子通道調(diào)控了BMSC對不同線性增加流體剪應(yīng)力刺激的力學(xué)敏感性。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 流體剪應(yīng)力 力學(xué)敏感型鈣離子通道 細(xì)胞骨架 細(xì)胞分化
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1 緒論9-15
• 1.1 問題的提出及研究意義9
• 1.1.1 問題的提出9
• 1.1.2 研究意義9
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀9-14
• 1.2.1 BMSCs 的生物學(xué)特性9-10
• 1.2.2 誘導(dǎo) BMSCs 分化的因素10-12
• 1.2.3 BMSCs 力學(xué)響應(yīng)信號(hào)12-14
• 1.3 論文研究的目的與內(nèi)容14-15
• 1.3.1 論文研究目的14
• 1.3.2 論文研究內(nèi)容14-15
• 2 BMSCs 對不同線性增加的流體剪應(yīng)力的力學(xué)敏感性響應(yīng)15-32
• 2.1 引言15
• 2.2 材料和方法15-24
• 2.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與接種15-17
• 2.2.2 流體剪應(yīng)力加載和鈣離子信號(hào)的實(shí)時(shí)觀測17-20
• 2.2.3 細(xì)胞骨架 F-actin 的檢測及其量化20-21
• 2.2.4 NO 的檢測以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制21-22
• 2.2.5 總蛋白的檢測以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制22-24
• 2.2.6 數(shù)據(jù)分析24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-29
• 2.3.1 BMSCs 對不同線性增加的流體剪應(yīng)力刺激的胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)24-27
• 2.3.2 BMSCs 對不同線性增加的流體剪應(yīng)力刺激的 NO 濃度變化27-28
• 2.3.3 BMSCs 對不同線性增加的流體剪應(yīng)力刺激后 F-actin 的變化28-29
• 2.4 討論29-31
• 2.5 本章小結(jié)31-32
• 3 BMSCs 對不同線性增加的流體剪應(yīng)力的分化表達(dá)32-39
• 3.1 引言32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法32-34
• 3.2.1 主要試劑和儀器32-33
• 3.2.2 加載實(shí)驗(yàn)33
• 3.2.3 堿性磷酸酶活性的測定33
• 3.2.4 糖胺聚糖的測定33-34
• 3.2.5 數(shù)據(jù)分析34
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-36
• 3.3.1 ALP 的結(jié)果34-35
• 3.3.2 GAG 的結(jié)果35-36
• 3.4 討論36-38
• 3.5 本章小結(jié)38-39
• 4 力學(xué)敏感型鈣離子通道對 BMSCs 力學(xué)響應(yīng)的影響39-49
• 4.1 引言39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法39-40
• 4.3 數(shù)據(jù)分析40
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-46
• 4.4.1 力學(xué)敏感型鈣離子通道對 BMSCs 胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)的貢獻(xiàn)40-43
• 4.4.2 力學(xué)敏感型鈣離子通道對 BMSCs F-actin 的影響43-44
• 4.4.3 力學(xué)敏感型鈣離子通道對 ALP 活性的影響44-45
• 4.4.4 力學(xué)敏感型鈣離子通道對 GAG 表達(dá)的影響45-46
• 4.5 討論46-48
• 4.6 本章小結(jié)48-49
• 5 結(jié)論與展望49-51
• 5.1 主要結(jié)論49
• 5.2 論文的不足之處與后續(xù)工作的展望49-51
• 致謝51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 附錄56

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本文編號(hào)：404116