本文關(guān)鍵詞：hBMP-2基因修飾的BMSCs促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 1.體外分離培養(yǎng)及擴(kuò)增純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs),為骨組織工程提供種子細(xì)胞。 2.通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù),建立穩(wěn)定表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2)的BMSCs細(xì)胞株。 3.檢測(cè)hBMP-2基因修飾的BMSCs對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響。 方法 1.取1-2個(gè)月的雜種幼犬,脛骨抽取骨髓3-4mL,全骨髓貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)及擴(kuò)增純化,觀察其形態(tài)。利用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)第3代的BMSCs,分別采用免疫細(xì)胞化學(xué)法、微量酶標(biāo)法及茜素紅染色檢測(cè)骨鈣素(Bone Gla Proteins, BGP)、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)的表達(dá)情況及鈣結(jié)節(jié)的形成情況。利用成軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)第3代BMSCs細(xì)胞團(tuán)塊,用HE染色及甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)軟骨生成的情況。 2.取第3代的BMSCs,用慢病毒介導(dǎo)的hBMP-2基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)表達(dá)情況,檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)分別檢測(cè)hBMP-2mRNA及其蛋白表達(dá)情況。MTT及流式細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后BMSCs生長(zhǎng)增殖能力。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)慢病毒介導(dǎo)的hBMP-2轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs遷移能力的影響。 3.相同實(shí)驗(yàn)條件下通過(guò)transwell系統(tǒng)共培養(yǎng),對(duì)比hBMP-2轉(zhuǎn)染的BMSCs與空病毒轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的BMSCs對(duì)共培養(yǎng)的BMSCs的促成骨分化作用,分別采用免疫細(xì)胞化學(xué)法、微量酶標(biāo)法及熒光定量PCR檢測(cè)BGP、ALP及Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen, COLL Ⅰ) mRNA的表達(dá)情況,茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)的生成情況。 結(jié)果 1.原代BMSCs貼壁呈集落式生長(zhǎng),8-10天后BMSCs鋪滿(mǎn)瓶底70%-80%,傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,漩渦狀排列,形態(tài)典型、均一,有較強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖能力。ALP檢測(cè)結(jié)果顯示ALP隨誘導(dǎo)天數(shù)增加而表達(dá)增多,與對(duì)照組有顯著差異(P0.05),免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)后BGP呈強(qiáng)陽(yáng)性,表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.05),BMSCs茜素紅染色可見(jiàn)陽(yáng)性表現(xiàn)的鈣結(jié)節(jié)。說(shuō)明分離培養(yǎng)的BMSCs可定向分化成成骨細(xì)胞。成軟骨誘導(dǎo)后的BMSCs細(xì)胞團(tuán)塊行HE染色可觀察到典型的軟骨組織形態(tài),行甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)軟骨基質(zhì)形成異染性的紫紅,說(shuō)明分離培養(yǎng)的BMSCs可定向向軟骨細(xì)胞分化。 2.慢病毒介導(dǎo)的hBMP-2成功轉(zhuǎn)染犬BMSCs,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70%-80%；RT-PCR可檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后hBMP-2mRNA的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)可檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后BMP-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。MTT檢測(cè)生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前后BMSCs生長(zhǎng)增殖情況無(wú)明顯改變,流式法測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期無(wú)明顯改變,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后仍有較強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖能力；transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后hBMP-2基因組BMSCs的遷移數(shù)量明顯增多(P0.05),說(shuō)明BMP-2轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)BMSCs的運(yùn)動(dòng)遷移能力。 3.共培養(yǎng)后hBMP-2基因轉(zhuǎn)染組的BMSCs的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果BGP呈陽(yáng)性,茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)呈陽(yáng)性,ALP表達(dá)增多,熒光定量PCR法檢測(cè)Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平增高,與未轉(zhuǎn)染組及空載病毒組比較均有顯著差異(P＜0.05),因此慢病毒介導(dǎo)hBMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs表達(dá)分泌的BMP2可誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。 結(jié)論 1.全骨髓貼壁法簡(jiǎn)單、易行,可成功培養(yǎng)、擴(kuò)增出大量純化的犬BMSCs,能為骨組織工程提供足夠的種子細(xì)胞。并且所獲細(xì)胞可成功向成骨及成軟骨方向誘導(dǎo)分化。 2.慢病毒介導(dǎo)的hBMP-2可成功、高效的轉(zhuǎn)染犬BMSCs,并可穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2mRNA及其蛋白。 3.慢病毒介導(dǎo)的hBMP-2轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無(wú)明顯影響,且可增強(qiáng)BMSCs的遷移運(yùn)動(dòng)能力。 4. Transwell共培養(yǎng)可簡(jiǎn)單模擬體內(nèi)微環(huán)境,且轉(zhuǎn)基因BMSCs表達(dá)分泌的BMP2可誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒載體 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 人骨形成蛋白2 共培養(yǎng) 成骨
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)對(duì)照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-18
• 論文正文18-68
• 試驗(yàn)一：犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定18-35
• 1 材料及器械18-20
• 2 試驗(yàn)方法20-24
• 3 結(jié)果24-31
• 4 討論31-35
• 實(shí)驗(yàn)二：慢病毒介導(dǎo)的hBMP-2基因轉(zhuǎn)染對(duì)犬骨髓間充質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響35-55
• 1 材料與器械35-37
• 2 實(shí)驗(yàn)方法37-43
• 3 結(jié)果43-52
• 4 討論52-55
• 實(shí)驗(yàn)三：hBMP-2基因修飾的BMSCs促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究55-68
• 1 材料與器械56-57
• 2 實(shí)驗(yàn)方法57-60
• 3 結(jié)果60-65
• 4 討論65-68
• 結(jié)論68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 二、文獻(xiàn)綜述75-87
• 參考文獻(xiàn)82-87
• 三、致謝87-88
• 四、攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的論文88

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

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本文編號(hào)：403982