人乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)是嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)正嗜肝病毒屬病毒,具有肝臟嗜性,可引起人肝臟急性、慢性感染,肝硬化和肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。流行病學(xué)資料和諸多研究結(jié)果證明HBV感染可能是HCC發(fā)生的首要誘因,這與肝細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和再生的調(diào)控特點(diǎn),HBV編碼的X蛋白(HBx)的結(jié)構(gòu)和功能特性有著密切的關(guān)系。HBx蛋白主要通過(guò)與細(xì)胞蛋白的相互作用來(lái)調(diào)控和激活宿主細(xì)胞和病毒基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),影響細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞中受損DNA的外切修復(fù)反應(yīng)以及激活細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如MAPK、JAK、STAT)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),以及調(diào)控病毒自身的復(fù)制與增殖等。到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與HBx蛋白相互作用的細(xì)胞和其他病原蛋白有幾十種,功能范圍涉及到肝細(xì)胞的生長(zhǎng)、調(diào)亡和再生過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控,肝細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄,DNA的修復(fù)及其調(diào)控,大分子在核與胞漿間穿梭等。目前還沒(méi)有足夠的證據(jù)闡明HBx蛋白在HCC的發(fā)生與發(fā)展中的確切分子機(jī)制。因此,分離鑒定新的與HBx相互作用的宿主或其它病原生物的蛋白因子、闡明其功能等,是揭示HBx...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
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英文摘要
第一章 前言
    1.1 HBV及其相關(guān)的疾病
        1.1.1 HBV分子生物學(xué)及其研究進(jìn)展
            1.1.1.1 HBV基因組結(jié)構(gòu)及其功能特點(diǎn)
            1.1.1.2 HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄
            1.1.1.3 HBV編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能
                1.1.1.3.1 囊膜蛋白
                1.1.1.3.2 病毒核心蛋白及e抗原
                1.1.1.3.3 病毒的P蛋白
                1.1.1.3.4 HBx蛋白
        1.1.2 肝臟是嗜肝DNA病毒感染的靶器官
            1.1.2.1 肝細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子
            1.1.2.2 肝細(xì)胞凋亡、增殖和再生相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
    1.2 HCC的分子病理學(xué)
        1.2.1 HBV病毒基因在HCC形成過(guò)程中的作用
        1.2.2 HBx在HCC形成過(guò)程中的作用
    1.3 HBx蛋白及相關(guān)細(xì)胞蛋白的研究進(jìn)展
        1.3.1 HBx的表達(dá)與調(diào)控
        1.3.2 HBx蛋白及其相互作用蛋白質(zhì)
        1.3.3 受HBx蛋白調(diào)控的基因或蛋白質(zhì)
        1.3.4 HBx蛋白參與調(diào)控的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            1.3.4.1 HBx激活蛋白激酶C
            1.3.4.2 HBx上調(diào)NF-κB
            1.3.4.3 HBx激活Ras-raf-MAPK信號(hào)盒
            1.3.4.4 HBx激活應(yīng)激激活蛋白激酶和Jun N-末端激酶途徑
            1.3.4.5 HBx激活蛋白激酶B(PKB/Akt)途徑
            1.3.4.6 HBx蛋白上調(diào)Janus激酶/STAT途徑
        1.3.5 HBx蛋白與肝細(xì)胞凋亡
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 HBV基因組的克隆及其遺傳演化分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 血清
        2.1.2 菌種、質(zhì)粒
        2.1.3 HBV基因組DNA的提取
        2.1.4 HBV全基因組的擴(kuò)增
        2.1.5 PCR產(chǎn)物的回收
        2.1.6 HBV基因組DNA的酶切鑒定
        2.1.7 HBV全基因組與T載體的連接
        2.1.8 連接產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化
            2.1.8.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.1.8.2 電轉(zhuǎn)化
        2.1.9 質(zhì)粒的提取
        2.1.10 重組質(zhì)粒pGEM-HBV的酶切鑒定
        2.1.11 HBV核苷酸序列測(cè)定
        2.1.12 HBV的序列分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 HBV全基因組PCR擴(kuò)增
        2.2.2 HBV基因組DNA的酶切鑒定
        2.2.3 重組質(zhì)粒pGEM-HBV的酶切鑒定
        2.2.4 HBV全基因組核苷酸序列測(cè)定及其遺傳演化分析
    2.3 討論
第三章 HBx基因相關(guān)載體的構(gòu)建及其鑒定
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 HBx和HBs基因的擴(kuò)增
        3.1.3 HBx和HBs PCR產(chǎn)物純化、連接及轉(zhuǎn)化
        3.1.4 重組質(zhì)粒pGBKT7-x和pGBKT7-HBs酶切鑒定
        3.1.5 重組質(zhì)粒pGBKT7-x和pGBKT7-HBs核苷酸序列測(cè)定
        3.1.6 HBx基因的核苷酸序列分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 PCR擴(kuò)增HBx和HBs基因
        3.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.3 重組質(zhì)粒pGBKT7-HBx和pGBKT7-HBs核苷酸序列測(cè)定
        3.2.4 HBx基因的核苷酸序列及其遺傳演化分析
        3.2.5 HBx蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.3 討論
第四章 HBx相互作用細(xì)胞蛋白基因的篩選
    4.1 材料與方法
        4.1.1 酵母雙雜交系統(tǒng)預(yù)制文庫(kù)
        4.1.2 pGBKT7-x的酵母轉(zhuǎn)化
            4.1.2.1 酵母菌AH109的培養(yǎng)及其表型鑒定
            4.1.2.2 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            4.1.2.3 酵母的轉(zhuǎn)化
        4.1.3 陽(yáng)性菌株表型鑒定
            4.1.3.1 轉(zhuǎn)化菌落的表型鑒定
            4.1.3.2 HBx對(duì)酵母的毒性測(cè)試
            4.1.3.3 HBx基因轉(zhuǎn)錄自激活測(cè)試
        4.1.4 預(yù)制文庫(kù)的篩選
            4.1.4.1 HBx Bait酵母菌株的培養(yǎng)及其增菌
            4.1.4.2 Mating試驗(yàn)
            4.1.4.3 Mating試驗(yàn)中菌落轉(zhuǎn)移及純化
        4.1.5 酵母菌質(zhì)粒的提取
        4.1.6 酵母菌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        4.1.7 AD質(zhì)粒的提取及鑒定
        4.1.8 AD質(zhì)粒和Bait質(zhì)粒pGBKT7—HBx共轉(zhuǎn)化
        4.1.9 AD片段的序列測(cè)定
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 酵母菌的表型鑒定
        4.2.2 HBx蛋白對(duì)酵母的毒性測(cè)試
        4.2.3 HBx基因轉(zhuǎn)錄自激活測(cè)試
        4.2.4 Mating試驗(yàn)
        4.2.5 陽(yáng)性克隆的鑒定及其分析
            4.2.5.1 陽(yáng)性克隆的PCR鑒定
            4.2.5.2 陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物的酶切鑒定
            4.2.5.3 陽(yáng)性克隆AD質(zhì)粒的提取及鑒定
        4.2.6 陽(yáng)性克隆的核苷酸序列測(cè)定及其序列分析
    4.3 討論
第五章 陽(yáng)性克隆的體外體內(nèi)鑒定
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 體外翻譯
            5.1.2.1 AD片段編碼區(qū)體外翻譯模板的擴(kuò)增及其純化
            5.1.2.2 Bait蛋白HBx體外翻譯
            5.1.2.3 AD蛋白體外翻譯
        5.1.3 免疫沉淀及其檢測(cè)
        5.1.4 HBx蛋白與其相互作用蛋白免疫熒光共定位
            5.1.4.1 相關(guān)基因表達(dá)載體的構(gòu)建
            5.1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
            5.1.4.3 免疫熒光標(biāo)記及其檢測(cè)
        5.1.5 體內(nèi)免疫共沉淀試驗(yàn)
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 AD片段編碼區(qū)體外翻譯模板的擴(kuò)增
        5.2.2 免疫沉淀及其檢測(cè)
        5.2.3 HBx蛋白和AD蛋白免疫共定位研究相關(guān)基因表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.2.4 HBx蛋白與其相互作用蛋白免疫熒光共定位試驗(yàn)
        5.2.5 HBx蛋白與其相互作用蛋白免疫共沉淀試驗(yàn)
    5.3 討論
第六章 HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用的細(xì)胞功能研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 材料
        6.1.2 細(xì)胞
        6.1.3 臨床組織樣品總RNA的提取
        6.1.4 Hepsin蛋白基因擴(kuò)增
        6.1.5 Hepsin蛋白基因克隆及其鑒定
        6.1.6 Hepsin蛋白基因序列測(cè)定
        6.1.7 細(xì)胞增殖活性測(cè)定
        6.1.8 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡率的測(cè)定
        6.1.9 DAPI染色分析
        6.1.10 Hepsin蛋白與HBx蛋白相互作用對(duì)HBV蛋白表達(dá)及病毒復(fù)制影響
    6.2 結(jié)果
        6.2.1 Hepsin基因的擴(kuò)增及其克隆
        6.2.2 Hepsin基因核苷酸序列測(cè)定及其序列分析
        6.2.3 Hepsin基因在臨床樣品中表達(dá)水平研究
        6.2.4 Hepsin蛋白與HBx蛋白相互作用對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響
        6.2.5 Hepsin蛋白與HBx蛋白相互作用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
        6.2.6 Hepsin蛋白與HBx蛋白相互作用對(duì)HBV蛋白表達(dá)及病毒復(fù)制影響
    6.3 討論
研究總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 論文涉及引物一覽表
附錄Ⅱ 論文涉及的試劑及其配制
附錄Ⅲ 在讀期間發(fā)表文章
致謝



本文編號(hào)：4031405