本文關(guān)鍵詞：MSX1、PAX9、DLX1基因的克隆及共表達(dá)載體的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牙齒發(fā)育是口腔上皮和神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的過程,是十分復(fù)雜并受到精密調(diào)控的,多種信號(hào)分子、受體、轉(zhuǎn)錄因子參與其中,構(gòu)成時(shí)間和空間上復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系,調(diào)控著牙齒發(fā)育的進(jìn)程。DPSC是由Gronthos等從成人牙齒中酶消化法分離出高度增殖的一類細(xì)胞,有較高的克隆形成率。DPSC具有多向分化潛能,在不同微環(huán)境下可以分化成不同細(xì)胞,最顯著的特征就是分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞,以牙髓干細(xì)胞為種子細(xì)胞的牙齒修復(fù)技術(shù)成為近年來牙齒再生工程的研究熱點(diǎn),細(xì)胞分化過程中多種信號(hào)分子、轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子的調(diào)控,這些分子調(diào)控機(jī)制共同決定細(xì)胞分化的方向,其中一些具有同源盒結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子如：Msx、Gil、Pax、Barx等,通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞定向分化和誘導(dǎo)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。本研究從正畸牙中分離和培養(yǎng)DPSC,體外成功誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞,證實(shí)了DPSC具有多向分化潛能的特性,提取20W人牙胚RNA,逆轉(zhuǎn)錄為單鏈的cDNA, RT-PCR克隆DLX1cDNA序列,確定人牙胚中表達(dá)的DLX1轉(zhuǎn)錄子亞型為亞型I,原位雜交檢測(cè)DLXl轉(zhuǎn)錄子在人磨牙發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)模式,DLX1在11w、14W、17W在間充質(zhì)和上皮都有表達(dá)、到20W強(qiáng)烈表達(dá)在內(nèi)釉上皮中。構(gòu)建由人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(PhCMV)多克隆位點(diǎn)MCS-開放閱讀框ORF-終止序列SV40polyA組成的表達(dá)盒,由ORF引入MSX1、PAX9、DLX1cDNA序列,最終構(gòu)建pCMV'-MSX1-PAX9-DLX1串聯(lián)的共表達(dá)載體,并進(jìn)行功能的驗(yàn)證,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到DPSC中,檢測(cè)DPSC分化情況,DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的特異性指標(biāo)是表達(dá)牙本質(zhì)唾液磷蛋白(DSPP),成骨分化的標(biāo)記基因是RUNX2和OST4, RT-PCR檢測(cè)表達(dá)量上升,而DSPP沒有表達(dá),說明DPSC經(jīng)過誘導(dǎo)后向成骨方向分化而沒有向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化。
【關(guān)鍵詞】：牙髓干細(xì)胞 多基因共表達(dá)載體 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 成骨
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-7
• 目錄7-10
• 緒論10-22
• 一、牙齒的發(fā)育10-15
• 1. 小鼠和人的牙齒發(fā)育過程10-11
• 2. 哺乳動(dòng)物牙齒發(fā)育的分子機(jī)制11-15
• 二、多基因共表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展15-18
• 1. 單啟動(dòng)子多基因(多順反子)系統(tǒng)16-17
• 2. 單基因多載體共表達(dá)系統(tǒng)17
• 3. 多重轉(zhuǎn)錄單元多基因系統(tǒng)17-18
• 三、牙髓干細(xì)胞為基礎(chǔ)的牙齒再生的研究進(jìn)展18-20
• 四、本實(shí)驗(yàn)研究的目的和意義20-22
• 第一章 材料和方法22-38
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料22-27
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料的來源22
• 1.1.2 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞22
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑23
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑配方23-26
• 1.1.6 PCR引物26-27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-38
• 1.2.1 質(zhì)粒的改造27-32
• 1.2.2 cDNA克隆32
• 1.2.3 RNA探針制備32-33
• 1.2.4 原位雜交檢測(cè)33-34
• 1.2.5 牙髓干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)34-35
• 1.2.6 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存35
• 1.2.7 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染步驟35-36
• 1.2.8 細(xì)胞總蛋白提取36
• 1.2.9 Western blot36-38
• 第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-54
• 2.1 人牙胚表達(dá)的DLX1為轉(zhuǎn)錄子亞型138-40
• 2.2 DLX1轉(zhuǎn)錄因子在人牙胚發(fā)育過程中的表達(dá)檢測(cè)40
• 2.3 MSX1、PAX9、DLX1共表達(dá)載體的構(gòu)建40-46
• 2.3.1 改造質(zhì)粒示意圖40-41
• 2.3.2 pEcoRI~+的構(gòu)建41-42
• 2.3.3 pCMV的構(gòu)建42-43
• 2.3.4 MSXl片段的獲得43
• 2.3.5 構(gòu)建pCMV-MSX1、pCMV-PAX9、pCMV.DLXW143-44
• 2.3.6 構(gòu)建pCMV-MSX1-PAX9-DLX1質(zhì)粒44-45
• 2.3.7 構(gòu)建pCMV~--MSX1-PAX9-DLX1質(zhì)粒45-46
• 2.4 多基因共表達(dá)對(duì)DPSC分化的影響46-54
• 2.4.1 牙髓干細(xì)胞分離和培養(yǎng)47
• 2.4.2 牙髓干細(xì)胞多向分化潛能的鑒定47-48
• 2.4.3 優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,確定轉(zhuǎn)染時(shí)間48-49
• 2.4.4 優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,調(diào)整DNA/lipo 2000劑量比49-50
• 2.4.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染共表達(dá)載體到DPSC、hEDMC、ihEDMC4初步檢測(cè)MSX1、PAX9、DLX1的表達(dá)50-52
• 2.4.6 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DPSC,2W后收獲細(xì)胞,檢測(cè)DPSC分化方向52-54
• 第三章 分析和討論54-58
• 3.1 多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建54-55
• 3.2 目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞55-56
• 3.3 共表達(dá)載體對(duì)DPSC分化的影響56-57
• 3.4 本實(shí)驗(yàn)的研究展望57-58
• 第四章 結(jié)論58-60
• 附錄160-62
• 附錄262-64
• 附錄364-66
• 附錄466-68
• 參考文獻(xiàn)68-76
• 致謝76-78

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王琳;靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建絲素/膠原/有機(jī)高分子聚合物組織工程支架的初步研究[D];蘭州大學(xué);2014年

2 何穎;小鼠牙胚在腎包膜及口腔頰黏膜下成牙能力的對(duì)比研究[D];暨南大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：MSX1、PAX9、DLX1基因的克隆及共表達(dá)載體的構(gòu)建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：403007