本文關(guān)鍵詞：Neuritin慢病毒修復(fù)大鼠受損視神經(jīng)和RGC5的作用及機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 視神經(jīng)損傷是目前許多臨床眼部疾病和外傷治療的難點。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（Retinal Ganglion Cells，RGCs）的丟失及再生困難，是視神經(jīng)損傷導致視神經(jīng)萎縮和失明的關(guān)鍵因素，如何進行有效的逆轉(zhuǎn)治療一直是眼科和神經(jīng)科學領(lǐng)域面臨的難題之一。Neuritin又名可塑性相關(guān)候選基因15（candidate plasticity-related gene15，CPG15），是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的新成員。Neuritin主要表達于神經(jīng)系統(tǒng)中，Neuritin是神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)活動發(fā)揮作用的共同下游因子，在抑制神經(jīng)細胞凋亡、促進軸突生長、促進突觸成熟和調(diào)節(jié)突觸可塑性等方面均具有重要作用。 本實驗基于Neuritin獨特的神經(jīng)營養(yǎng)作用及其在神經(jīng)創(chuàng)傷、疾病中的變化和作用，研究視神經(jīng)損傷后Neuritin基因在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達變化，并以Neuritin為靶進行治療，推測其對RGCs的存活和再生這一視神經(jīng)損傷和疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有明顯的作用，將有助于進一步揭示視神經(jīng)再生難的原因和探討視神經(jīng)修復(fù)的新方法。方法： （1）視神經(jīng)夾傷模型的制作：用Yasargil腦動脈瘤夾于成年雄性大鼠視神經(jīng)眼球后約1mm處夾傷9s，模擬臨床造成視神經(jīng)不完全損傷。采用HE染色、CTB追蹤、透射電鏡觀察等方法觀察視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)的形態(tài)變化。 （2）觀察Neuritin在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的時空表達變化：應(yīng)用免疫熒光雙標的方法檢測Neuritin在組織細胞中的定位，再分別應(yīng)用Western blot和Real time PCR的方法檢測視神經(jīng)損傷后Neuritin在蛋白和mRNA水平的表達變化。 （3）構(gòu)建Neuritin慢病毒質(zhì)粒并包裝測定其滴度。 （4）體內(nèi)觀察Neuritin過表達對受損大鼠RGCs及視神經(jīng)的作用：大鼠視神經(jīng)夾傷前1周玻璃體注射Neuritin慢病毒，損傷2周后采用CTB順行標記RGCs以觀察其存活及軸突的再生情況。 （5）體外觀察Neuritin蛋白或過表達對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞系（Retinal GanglionCell-5, RGC5）的作用及機制：采用CCK8法或MTT法檢測Neuritin蛋白對受損RGC5存活的影響，相差顯微鏡拍照觀察Neuritin過表達對RGC5突起長度的影響，DAPI染色和Western blot方法分別檢測Neuritin對RGC5細胞凋亡的影響；進一步通過Western blot檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子pSTAT3、pAKT和pERK的表達。 結(jié)果： （1）正常視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中Neuritin蛋白的表達定位：免疫熒光雙標的結(jié)果顯示在正常視網(wǎng)膜中Neuritin蛋白主要表達于RGCs胞體和突起及部分星形膠質(zhì)細胞中；正常視神經(jīng)中Neuritin蛋白主要表達于RGCs軸突、少突膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞中。 （2）成功建立視神經(jīng)不完全損傷模型：HE染色結(jié)果顯示視神經(jīng)損傷后損傷區(qū)神經(jīng)外膜保持完整，CTB追蹤結(jié)果顯示神經(jīng)損傷后遠側(cè)端仍保留有正常運輸功能的軸突，透射電鏡結(jié)果顯示視交叉前段視神經(jīng)仍保留有正常樣軸突。 （3）視神經(jīng)受損后Neuritin在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的時空表達變化規(guī)律：Westernblot顯示視神經(jīng)受損后1d Neuritin蛋白在視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中表達升高，，傷后3d、7d均高表達，其后緩慢下調(diào)至正常水平，Real time PCR的結(jié)果顯示傷后1d NeuritinmRNA瞬時表達高表達，其后下調(diào)至或低于正常水平。 （4）成功構(gòu)建Neuritin慢病毒質(zhì)粒，并獲得高滴度的Neuritin慢病毒顆粒。 （5）體內(nèi)Neuritin過表達對受損大鼠RGCs及視神經(jīng)的作用：損傷后2周Neuritin過表達組RGCs的存活明顯增加，存留及再生的軸突顯著增多。 （6）體外Neuritin蛋白及過表達對RGC5的作用及機制：CCK8法結(jié)果顯示重組的人Neuritin蛋白可增加受損RGC5的存活，Neuritin過表達可增加RGC5最長突起的長度；DAPI染色及Caspase3表達的檢測顯示Neuritin過表達可以減少受損RGC5細胞的凋亡及活化型Caspase3的表達。神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)信號通路的檢測顯示Neuritin過表達可下調(diào)pSTAT3蛋白的表達，并上調(diào)pAKT和pERK蛋白的表達。 結(jié)論： （1）Neuritin在正常視網(wǎng)膜中主要表達于RGCs及部分星形膠質(zhì)細胞中，在視神經(jīng)中主要表達于RGCs軸突、少突膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞。 （2）采用Yasagil腦動脈瘤夾夾傷視神經(jīng)，可建立視神經(jīng)不完全損傷模型。 （3）視神經(jīng)損傷早期視網(wǎng)膜及視神經(jīng)內(nèi)Neuritin的高表達，而后期Neuritin表達的不足提示可能為RGCs大量死亡和軸突再生失敗的原因之一。 （4）體內(nèi)實驗初步證實Neuritin過表達對視神經(jīng)損傷后的RGCs有保護作用，可以有效促進RGCs的存活及其軸突的再生。 （5）體外實驗證明Neuritin慢病毒或蛋白可促進受損RGC5的存活，抑制細胞凋亡并促進突起的生長。上述作用可能是通過抑制STAT3通路并激活A(yù)KT和ERK信號通路實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：Neuritin 視神經(jīng) 視網(wǎng)膜節(jié)細胞 損傷 基因治療 神經(jīng)修復(fù)
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 第一部分 Neuritin 在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達變化13-36
• 一、前言13-15
• 二、實驗材料15-17
• 三、實驗方法17-25
• （一）組織學切片17-18
• （二）免疫組織化學18
• （三）免疫熒光組織化學18-19
• （四）動物模型的制作19-20
• （五）伊紅蘇木素（HE）染色20
• （六）視神經(jīng)順行束路追蹤20-21
• （七）透射電子顯微鏡觀察21
• （八）免疫印跡法(Western blot)21-23
• （九）實時熒光定量 PCR23-24
• （十）統(tǒng)計學分析24-25
• 四、結(jié)果25-32
• （一） Neuritin 在正常視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達定位25-28
• （二）動物模型的建立28-31
• （三） Neuritin 在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達變化31-32
• 五、討論32-36
• （一） Neuritin 在正常視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達定位32-34
• （二）建立視神經(jīng)不完全損傷模型34
• （三）Neuritin 在視神經(jīng)受損后視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中的表達變化34-36
• 第二部分 Neuritin 慢病毒對受損視神經(jīng)和 RGC5 的修復(fù)作用及機制36-77
• 一、前言36
• 二、實驗材料36-41
• 三、實驗方法41-52
• （一）目的基因片段獲取41-42
• （二）慢病毒載體及 Nrn1 基因的酶切連接和轉(zhuǎn)化42-44
• （三）Nrn1 基因慢病毒質(zhì)粒的抽提及鑒定44-45
• （四）病毒包裝細胞 293T 細胞的培養(yǎng)45-46
• （五）慢病毒生產(chǎn)及滴度測定46-47
• （六）動物實驗分組47-48
• （七）視神經(jīng)損傷形態(tài)學指標檢測48
• （八）RGC5 的培養(yǎng)及誘導分化48
• （九）RGC5 損傷模型的建立48-49
• （十）RGC5 損傷后 Neuritin 表達變化的檢測49
• （十一）Neuritin 基因過表達及實驗分組49-50
• （十二）細胞存活率的檢測50
• （十三）細胞突起長度的檢測50
• （十四）細胞凋亡的檢測50-51
• （十五）神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)信號通路蛋白表達的檢測51
• （十六）統(tǒng)計學分析51-52
• 四、結(jié)果52-72
• （一）Neuritin 慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建52-55
• （二）Neuritin 慢病毒重組病毒的包裝55-57
• （三）Neuritin 對受損視神經(jīng)的作用57-60
• （四）Neuritin 在體外對 RGC5 的作用及機制60-72
• 五、討論72-77
• （一）慢病毒基因治療72-73
• （二）Neuritin 慢病毒載體對大鼠視神經(jīng)損傷的修復(fù)作用73
• （三）RGC5 損傷模型的建立73-74
• （四）Neuritin 蛋白或者過表達對受損 RGC5 的保護作用74-75
• （五）Neuritin 保護作用的可能作用機制75-77
• 全文小結(jié)77-78
• 創(chuàng)新點及意義78-79
• 附錄79-81
• 參考文獻81-86
• 綜述86-94
• 參考文獻92-94
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明94-95
• 致謝95-96

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李樂翔;趙永更;張磊;費舟;;Neuritin基因在膠質(zhì)瘤組織中的表達研究[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2009年05期

  本文關(guān)鍵詞：Neuritin慢病毒修復(fù)大鼠受損視神經(jīng)和RGC5的作用及機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：403024