本文關(guān)鍵詞：Neuritin慢病毒修復(fù)大鼠受損視神經(jīng)和RGC5的作用及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 視神經(jīng)損傷是目前許多臨床眼部疾病和外傷治療的難點(diǎn)。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Retinal Ganglion Cells，RGCs）的丟失及再生困難，是視神經(jīng)損傷導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮和失明的關(guān)鍵因素，如何進(jìn)行有效的逆轉(zhuǎn)治療一直是眼科和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域面臨的難題之一。Neuritin又名可塑性相關(guān)候選基因15（candidate plasticity-related gene15，CPG15），是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的新成員。Neuritin主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)中，Neuritin是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)活動(dòng)發(fā)揮作用的共同下游因子，在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、促進(jìn)突觸成熟和調(diào)節(jié)突觸可塑性等方面均具有重要作用。 本實(shí)驗(yàn)基于Neuritin獨(dú)特的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用及其在神經(jīng)創(chuàng)傷、疾病中的變化和作用，研究視神經(jīng)損傷后Neuritin基因在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達(dá)變化，并以Neuritin為靶進(jìn)行治療，推測(cè)其對(duì)RGCs的存活和再生這一視神經(jīng)損傷和疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有明顯的作用，將有助于進(jìn)一步揭示視神經(jīng)再生難的原因和探討視神經(jīng)修復(fù)的新方法。方法： （1）視神經(jīng)夾傷模型的制作：用Yasargil腦動(dòng)脈瘤夾于成年雄性大鼠視神經(jīng)眼球后約1mm處夾傷9s，模擬臨床造成視神經(jīng)不完全損傷。采用HE染色、CTB追蹤、透射電鏡觀察等方法觀察視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)的形態(tài)變化。 （2）觀察Neuritin在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的時(shí)空表達(dá)變化：應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測(cè)Neuritin在組織細(xì)胞中的定位，再分別應(yīng)用Western blot和Real time PCR的方法檢測(cè)視神經(jīng)損傷后Neuritin在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化。 （3）構(gòu)建Neuritin慢病毒質(zhì)粒并包裝測(cè)定其滴度。 （4）體內(nèi)觀察Neuritin過(guò)表達(dá)對(duì)受損大鼠RGCs及視神經(jīng)的作用：大鼠視神經(jīng)夾傷前1周玻璃體注射N(xiāo)euritin慢病毒，損傷2周后采用CTB順行標(biāo)記RGCs以觀察其存活及軸突的再生情況。 （5）體外觀察Neuritin蛋白或過(guò)表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系（Retinal GanglionCell-5, RGC5）的作用及機(jī)制：采用CCK8法或MTT法檢測(cè)Neuritin蛋白對(duì)受損RGC5存活的影響，相差顯微鏡拍照觀察Neuritin過(guò)表達(dá)對(duì)RGC5突起長(zhǎng)度的影響，DAPI染色和Western blot方法分別檢測(cè)Neuritin對(duì)RGC5細(xì)胞凋亡的影響；進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子pSTAT3、pAKT和pERK的表達(dá)。 結(jié)果： （1）正常視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中Neuritin蛋白的表達(dá)定位：免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示在正常視網(wǎng)膜中Neuritin蛋白主要表達(dá)于RGCs胞體和突起及部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中；正常視神經(jīng)中Neuritin蛋白主要表達(dá)于RGCs軸突、少突膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中。 （2）成功建立視神經(jīng)不完全損傷模型：HE染色結(jié)果顯示視神經(jīng)損傷后損傷區(qū)神經(jīng)外膜保持完整，CTB追蹤結(jié)果顯示神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)側(cè)端仍保留有正常運(yùn)輸功能的軸突，透射電鏡結(jié)果顯示視交叉前段視神經(jīng)仍保留有正常樣軸突。 （3）視神經(jīng)受損后Neuritin在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的時(shí)空表達(dá)變化規(guī)律：Westernblot顯示視神經(jīng)受損后1d Neuritin蛋白在視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中表達(dá)升高，，傷后3d、7d均高表達(dá)，其后緩慢下調(diào)至正常水平，Real time PCR的結(jié)果顯示傷后1d NeuritinmRNA瞬時(shí)表達(dá)高表達(dá)，其后下調(diào)至或低于正常水平。 （4）成功構(gòu)建Neuritin慢病毒質(zhì)粒，并獲得高滴度的Neuritin慢病毒顆粒。 （5）體內(nèi)Neuritin過(guò)表達(dá)對(duì)受損大鼠RGCs及視神經(jīng)的作用：損傷后2周Neuritin過(guò)表達(dá)組RGCs的存活明顯增加，存留及再生的軸突顯著增多。 （6）體外Neuritin蛋白及過(guò)表達(dá)對(duì)RGC5的作用及機(jī)制：CCK8法結(jié)果顯示重組的人Neuritin蛋白可增加受損RGC5的存活，Neuritin過(guò)表達(dá)可增加RGC5最長(zhǎng)突起的長(zhǎng)度；DAPI染色及Caspase3表達(dá)的檢測(cè)顯示Neuritin過(guò)表達(dá)可以減少受損RGC5細(xì)胞的凋亡及活化型Caspase3的表達(dá)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)信號(hào)通路的檢測(cè)顯示Neuritin過(guò)表達(dá)可下調(diào)pSTAT3蛋白的表達(dá)，并上調(diào)pAKT和pERK蛋白的表達(dá)。 結(jié)論： （1）Neuritin在正常視網(wǎng)膜中主要表達(dá)于RGCs及部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中，在視神經(jīng)中主要表達(dá)于RGCs軸突、少突膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。 （2）采用Yasagil腦動(dòng)脈瘤夾夾傷視神經(jīng)，可建立視神經(jīng)不完全損傷模型。 （3）視神經(jīng)損傷早期視網(wǎng)膜及視神經(jīng)內(nèi)Neuritin的高表達(dá)，而后期Neuritin表達(dá)的不足提示可能為RGCs大量死亡和軸突再生失敗的原因之一。 （4）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)Neuritin過(guò)表達(dá)對(duì)視神經(jīng)損傷后的RGCs有保護(hù)作用，可以有效促進(jìn)RGCs的存活及其軸突的再生。 （5）體外實(shí)驗(yàn)證明Neuritin慢病毒或蛋白可促進(jìn)受損RGC5的存活，抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)突起的生長(zhǎng)。上述作用可能是通過(guò)抑制STAT3通路并激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：Neuritin 視神經(jīng) 視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞 損傷 基因治療 神經(jīng)修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 第一部分 Neuritin 在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達(dá)變化13-36
• 一、前言13-15
• 二、實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 三、實(shí)驗(yàn)方法17-25
• （一）組織學(xué)切片17-18
• （二）免疫組織化學(xué)18
• （三）免疫熒光組織化學(xué)18-19
• （四）動(dòng)物模型的制作19-20
• （五）伊紅蘇木素（HE）染色20
• （六）視神經(jīng)順行束路追蹤20-21
• （七）透射電子顯微鏡觀察21
• （八）免疫印跡法(Western blot)21-23
• （九）實(shí)時(shí)熒光定量 PCR23-24
• （十）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24-25
• 四、結(jié)果25-32
• （一） Neuritin 在正常視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達(dá)定位25-28
• （二）動(dòng)物模型的建立28-31
• （三） Neuritin 在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達(dá)變化31-32
• 五、討論32-36
• （一） Neuritin 在正常視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的表達(dá)定位32-34
• （二）建立視神經(jīng)不完全損傷模型34
• （三）Neuritin 在視神經(jīng)受損后視網(wǎng)膜及視神經(jīng)中的表達(dá)變化34-36
• 第二部分 Neuritin 慢病毒對(duì)受損視神經(jīng)和 RGC5 的修復(fù)作用及機(jī)制36-77
• 一、前言36
• 二、實(shí)驗(yàn)材料36-41
• 三、實(shí)驗(yàn)方法41-52
• （一）目的基因片段獲取41-42
• （二）慢病毒載體及 Nrn1 基因的酶切連接和轉(zhuǎn)化42-44
• （三）Nrn1 基因慢病毒質(zhì)粒的抽提及鑒定44-45
• （四）病毒包裝細(xì)胞 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)45-46
• （五）慢病毒生產(chǎn)及滴度測(cè)定46-47
• （六）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組47-48
• （七）視神經(jīng)損傷形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè)48
• （八）RGC5 的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化48
• （九）RGC5 損傷模型的建立48-49
• （十）RGC5 損傷后 Neuritin 表達(dá)變化的檢測(cè)49
• （十一）Neuritin 基因過(guò)表達(dá)及實(shí)驗(yàn)分組49-50
• （十二）細(xì)胞存活率的檢測(cè)50
• （十三）細(xì)胞突起長(zhǎng)度的檢測(cè)50
• （十四）細(xì)胞凋亡的檢測(cè)50-51
• （十五）神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的檢測(cè)51
• （十六）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析51-52
• 四、結(jié)果52-72
• （一）Neuritin 慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建52-55
• （二）Neuritin 慢病毒重組病毒的包裝55-57
• （三）Neuritin 對(duì)受損視神經(jīng)的作用57-60
• （四）Neuritin 在體外對(duì) RGC5 的作用及機(jī)制60-72
• 五、討論72-77
• （一）慢病毒基因治療72-73
• （二）Neuritin 慢病毒載體對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷的修復(fù)作用73
• （三）RGC5 損傷模型的建立73-74
• （四）Neuritin 蛋白或者過(guò)表達(dá)對(duì)受損 RGC5 的保護(hù)作用74-75
• （五）Neuritin 保護(hù)作用的可能作用機(jī)制75-77
• 全文小結(jié)77-78
• 創(chuàng)新點(diǎn)及意義78-79
• 附錄79-81
• 參考文獻(xiàn)81-86
• 綜述86-94
• 參考文獻(xiàn)92-94
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說(shuō)明94-95
• 致謝95-96

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李樂(lè)翔;趙永更;張磊;費(fèi)舟;;Neuritin基因在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)研究[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2009年05期

  本文關(guān)鍵詞：Neuritin慢病毒修復(fù)大鼠受損視神經(jīng)和RGC5的作用及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：403024