本文關(guān)鍵詞：核仁素在血管新生中的作用及其機(jī)制初步探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：摘要：血管新生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,但其具體機(jī)制目前尚未完全明了。核仁素是一種具有多種生物學(xué)功能,在真核生物中高度保守的核仁磷酸蛋白,也是一種重要的RNA結(jié)合蛋白,具有在核仁、胞核、胞漿,甚至細(xì)胞膜表面穿梭的特性。大量研究表明,細(xì)胞膜表面核仁素參與血管新生的調(diào)節(jié)。然而,核仁素的RNA結(jié)合特性在血管新生中有何作用,目前仍不清楚。本研究在明確核仁素對血管新生起調(diào)節(jié)作用后,擬初步探討其RNA結(jié)合特性在血管新生中的作用及其可能的機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)首先通過建立小鼠心肌缺血模型,利用免疫組化和免疫熒光技術(shù)觀察血管新生和核仁素的表達(dá),并采用PCR和Western Blot技術(shù)檢測血管新生相關(guān)基因和核仁素的表達(dá)。其次,在細(xì)胞水平,建立VEGF誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成的模型,采用增加和降低核仁素表達(dá)的研究手段,探討核仁素在VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管型形成中的作用；同時(shí)利用PCR和Western Blot技術(shù)觀察血管新生相關(guān)基因的表達(dá)情況。最后利用蛋白質(zhì)-RNA免疫共沉淀技術(shù)探討血管新生中核仁素可能調(diào)控的相關(guān)靶基因,以闡明核仁素在血管新生中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.整體動物實(shí)驗(yàn)。 (1)免疫組化和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)：心肌缺血后15天,缺血組心肌組織中核仁素和血管內(nèi)皮鈣粘蛋白表達(dá)升高,與假手術(shù)組比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (2)PCR和Western Blot技術(shù)檢測顯示：缺血組心肌組織中核仁素和血管新生相關(guān)基因表達(dá)升高,與假手術(shù)組比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)HE染色顯示核仁素轉(zhuǎn)基因小鼠血管密度明顯增高,免疫組化、PCR和Western Blot技術(shù)檢測顯示血管新生相關(guān)基因表達(dá)升高,與野生型小鼠相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。 (1)PCR和Western Blot技術(shù)檢測顯示VEGF可誘導(dǎo)HUVEC核仁素表達(dá)升高,并在一定程度上呈時(shí)間和濃度依賴性。 (2)核仁素過表達(dá)能促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成；反之,siRNA介導(dǎo)的核仁素低表達(dá)則能抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成。 (3)生物信息學(xué)分析顯示多個(gè)血管新生相關(guān)基因如VE-cadherin, Tie-2, MMP9, Endoglin, COX43等的mRNA含有一個(gè)或多個(gè)核仁素的結(jié)合元件。 (4)PCR和Western Blot技術(shù)檢測顯示siRNA介導(dǎo)的核仁素低表達(dá)能抑制血管新生相關(guān)基因的表達(dá)。 (5)利用蛋白質(zhì)-RNA免疫沉淀技術(shù),發(fā)現(xiàn)核仁素與血管新生相關(guān)基因MMP9, Endoglin, integrin a V有相互作用。 本實(shí)驗(yàn)可得出如下結(jié)論： 1.C23能促進(jìn)血管新生。 2.C23的RNA結(jié)合特性可能參與了VEGF介導(dǎo)的血管新生。
【關(guān)鍵詞】：核仁素 血管新生 血管內(nèi)皮生長因子 管型形成 內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 符號說明12-13
• 1 前言13-15
• 2 材料與方法15-22
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物,實(shí)驗(yàn)細(xì)胞15
• 2.1.2 主要試劑15-16
• 2.1.2.1 抗體15
• 2.1.2.2 其他主要試劑15-16
• 2.1.3 引物序列16-17
• 2.1.4 主要儀器17
• 2.2 方法17-22
• 2.2.1 動物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組17-18
• 2.2.2 小鼠心肌缺血模型的制備18
• 2.2.3 心肌組織、HUVEC總蛋白的提取和蛋白表達(dá)的免疫印跡分析18
• 2.2.4 心肌組織、HUVEC總RNA的提取,逆轉(zhuǎn)錄和PCR分析18-19
• 2.2.5 HE染色、免疫組化染色和免疫熒光染色19-20
• 2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)20
• 2.2.7 C23真核表達(dá)質(zhì)粒20
• 2.2.8 C23反義寡核苷酸的構(gòu)建20
• 2.2.9 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染20
• 2.2.10 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)20-21
• 2.2.11 管型形成實(shí)驗(yàn)21
• 2.2.12 蛋白質(zhì)-RNA免疫沉淀21
• 2.2.13 統(tǒng)計(jì)分析21-22
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-43
• 3.1 小鼠心肌缺血時(shí)C23的表達(dá)和血管新生的變化22-28
• 3.1.1 小鼠心肌缺血時(shí)C23的表達(dá)變化22-24
• 3.1.2 小鼠心肌缺血時(shí)血管新生的變化24-28
• 3.2 心肌特異性高表達(dá)C23的轉(zhuǎn)基因小鼠血管新生的變化28-33
• 3.3 C23高表達(dá)和低表達(dá)對血管新生的影響33-40
• 3.3.1 VEGF誘導(dǎo)HUVEC C23蛋白的變化33-34
• 3.3.2 VEGF誘導(dǎo)HUVEC中C23 mRNA的變化34-35
• 3.3.3 C23過表達(dá)和低表達(dá)對VEGF介導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移能力的影響35-36
• 3.3.4 C23過表達(dá)和低表達(dá)對VEGF介導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移的影響36-37
• 3.3.5 C23過表達(dá)和低表達(dá)對VEGF介導(dǎo)的HUVEC管型形成的影響37-39
• 3.3.6 C23低表達(dá)對VEGF介導(dǎo)的HUVEC中血管新生相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響39-40
• 3.4 生物信息學(xué)分析40-41
• 3.5 C23蛋白與血管新生相關(guān)基因mRNA的相互關(guān)系41-43
• 4 討論43-45
• 5 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 綜述50-64
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果目錄64-65
• 致謝65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：402101