本文關(guān)鍵詞：過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPARα）激活對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的HepG2細胞凋亡的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是不同于死亡受體途徑或線粒體損傷途徑的第三種細胞凋亡途徑。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)病毒性肝炎、酒精性肝損傷、脂肪肝、肝臟缺血再灌注損傷等肝臟損傷都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞凋亡有著密切的關(guān)系，因此抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減輕細胞凋亡是防治肝臟損傷的重要環(huán)節(jié)。過氧化物酶體增殖物激活受體-α（peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPARα）是配體激活的核受體PPARs家族的三個亞型之一，參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)。研究表明PPARα的選擇性激動劑WY14643可以抑制細胞凋亡，對重要臟器如心臟、肝臟、大腦和腎臟的缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護作用，而PPARα的選擇性拮抗劑MK886可引起細胞凋亡。我們前期研究也表示，WY14643對在體肝臟部分缺血再灌注損傷和大鼠肝細胞缺氧復(fù)氧損傷均具有保護作用，而這一作用是否與ERS有關(guān)尚未可知，本研究旨在探討PPARα激活對ERS誘導(dǎo)的人肝癌細胞株(HepG2)凋亡的影響，以闡明其肝臟保護作用的機制。 方法首先，為明確誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的最適過氧化氫（H_2O_2）濃度，選擇0.1mM、1mM、3mM的H_2O_2刺激HepG2細胞6小時，，并分別設(shè)置control組、WY14643alone組、DMSO alone組、WY14643預(yù)先給藥組和DMSO預(yù)先給藥組對比，采用MTT比色法和DAPI-PI雙染法檢測各組細胞活力；然后，根據(jù)上述實驗結(jié)果選擇最適的H_2O_2作用濃度，設(shè)置control組、DMSO alone組、WY14643alone組、H_2O_2alone組、WY14643+H_2O_2組和DMSO+H_2O_2組，采用賴氏法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性， TBA法檢測各組HepG2細胞丙二醛（MDA）含量， RT-PCR法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志分子BiP和CHOPmRNA轉(zhuǎn)錄水平，WB法檢測PPARα、BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平，觀察WY14643對H_2O_2誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響；最后，設(shè)置DMSO alone組、MK886alone組、H_2O_2alone組、WY14643+H_2O_2組和MK886+WY14643+H_2O_2組，采用賴氏法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力，TBA法檢測細胞MDA含量，RT-PCR法檢測BiP和CHOP mRNA轉(zhuǎn)錄水平，WB法檢測PPARα、BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細胞調(diào)亡率，免疫熒光法觀察CHOP蛋白質(zhì)在各組細胞內(nèi)定位及表達量，明確WY14643的作用是否依賴于PPARα的激活。統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x—±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果MTT比色法和DAPI-PI雙染法顯示，與對照組比較，DMSO alone組、WY14643alone組和0.1mM H_2O_2均不改變細胞活力，而1mM H_2O_2組和3mMH_2O_2組細胞活力明顯降低（P 0.05）；與1mM H_2O_2組，WY14643+1mM H_2O_2組細胞活力分別由59.6%±9.6%和56.1%±5.6%提高至92.6%±14.2%和96.4%±3.8%（P 0.05），DMSO+1mM H_2O_2組細胞活力無明顯變化；和3mM H_2O_2組相比，WY14643+3mM H_2O_2組細胞活力分別由30.2%±3.5%和32.0%±4.7%提高至45.6%±4.0%和52.8%±6.0%（P 0.05），DMSO+3mM H_2O_2組細胞活力無明顯變化。因此，后續(xù)試驗H_2O_2作用濃度均選擇1mM。 與control組相比，H_2O_2alone組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力增強（P 0.05），細胞MDA含量增加（P 0.05），BiP和CHOP mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)（P 0.05）， PPARα、BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平顯著上調(diào)（P 0.05），而WY14643alone組除PPARα蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)外，其余指標均無明顯變化， DMSO alone組各項指標均無明顯變化；而與H_2O_2alone組相比，WY14643+H_2O_2組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力顯著下降（P 0.05），細胞MDA含量降低（P 0.05），BiP和CHOP mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)（P 0.05），BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平下調(diào)（P 0.05），而DMSO+H_2O_2組則無明顯變化。 與DMSO alone組相比，H_2O_2alone組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力增強（P 0.05），細胞MDA含量增加（P 0.05），BiP和CHOP mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)（P 0.05），PPARα、BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)（P 0.05），MK886alone組和MK886+WY14643+H_2O_2組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力增強（P 0.05），細胞MDA含量增加（P 0.05），BiP和CHOP mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)（P 0.05），BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)（P 0.05），而PPARα蛋白質(zhì)表達顯著下調(diào)（P0.05）；與H_2O_2alone組相比，WY14643+H_2O_2組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力顯著下降（P 0.05），細胞MDA含量降低（P 0.05），BiP和CHOP mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)（P 0.05）， BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平下調(diào)（P 0.05）；與WY14643+H_2O_2組相比，MK886+WY14643+H_2O_2組細胞培養(yǎng)上清液ALT和AST活力增強（P 0.05），細胞MDA含量增加（P 0.05），BiP和CHOP mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)（P 0.05）， BiP和CHOP蛋白質(zhì)表達水平上調(diào)（P 0.05），而PPARα蛋白質(zhì)表達顯著下調(diào)（P 0.05）。 流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與control組相比，H_2O_2alone組和MK886alone組細胞凋亡率顯著上升（P0.05），而WY14643alone組則無明顯變化；與H_2O_2alone組相比，WY14643+H_2O_2組細胞凋亡率明顯下降（P0.05）；而與WY14643+H_2O_2組相比，MK886+WY14643+H_2O_2組細胞凋亡率又顯著性回升（P0.05）。最后，觀察到control組CHOP蛋白質(zhì)均位于細胞質(zhì)；而與control組相比，H_2O_2alone組和MK886alone組CHOP蛋白質(zhì)表達增加，且大部分位于細胞核；與H_2O_2alone組相比，WY14643+H_2O_2組CHOP表達顯著減少，且主要居于細胞質(zhì)；而與WY14643+H_2O_2組相比，MK886+WY14643+H_2O_2組CHOP表達現(xiàn)在增加，主要定位于細胞核。 結(jié)論WY14643可以激活PPARα，減少H_2O_2引起的HepG2細胞凋亡，改善HepG2細胞肝功能，作用機制可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)途徑抑制細胞凋亡，而這種保護效應(yīng)可以被MK886拮抗；并且MK886本身可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：PPARα 氧化應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 細胞凋亡 肝損傷
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 1 前言17-18
• 2 實驗材料18-22
• 2.1 細胞株18
• 2.2 抗體18-19
• 2.3 主要試劑來源及配制19-20
• 2.4 引物設(shè)計和合成20-21
• 2.5 實驗儀器21-22
• 3 實驗方法22-34
• 3.1 實驗分組22-23
• 3.2 細胞培養(yǎng)23-24
• 3.3 MTT 法檢測細胞活力24
• 3.4 DAPI-PI 雙染法檢測細胞活力24-25
• 3.5 HepG2 細胞培養(yǎng)上清液 ALT 測定（賴氏法）25-26
• 3.6 HepG2 細胞培養(yǎng)上清液 AST 測定（賴氏法）26-27
• 3.7 HepG2 細胞內(nèi) MDA 含量測定（TBA 法）27-28
• 3.8 流式細胞術(shù)28-29
• 3.8.1 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測細胞調(diào)亡原理28-29
• 3.8.2 操作流程29
• 3.9 RT-PCR29-31
• 3.9.1 RNA 提取29-30
• 3.9.2 RT 反應(yīng)30-31
• 3.9.3 PCR 擴增31
• 3.9.4 凝膠電泳和定量分析31
• 3.10 蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting，WB）31-33
• 3.10.1 蛋白樣品制備31-32
• 3.10.2 SDS-PAGE 凝膠制備32
• 3.10.3 上樣電泳32
• 3.10.4 轉(zhuǎn)膜32-33
• 3.10.5 WB 檢測33
• 3.11 細胞免疫熒光染色33
• 3.12 統(tǒng)計學(xué)處理33-34
• 4 結(jié)果34-45
• 4.1 WY14643 對 HepG2 細胞活力的影響34-36
• 4.1.1 MTT 法34-35
• 4.1.2 DAPI-PI 雙染法35-36
• 4.2 PPARα對 HepG2 細胞肝功能的影響36-38
• 4.3 PPARα對 HepG2 細胞 MDA 水平的影響38-39
• 4.4 PPARα對 HepG2 細胞凋亡率的影響（流式細胞術(shù)）39-40
• 4.5 PPARα對 HepG2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子 BiP 和 CHOP mRNA表達的影響40-42
• 4.6 PPARα對 HepG2 細胞 PPARα及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子 BiP 和CHOP 蛋白質(zhì)表達的影響42-44
• 4.7 PPARα對 HepG2 細胞內(nèi) CHOP 定位的影響44-45
• 5 討論45-46
• 6 結(jié)論46-47
• 7 本研究的創(chuàng)新點47
• 8 展望47
• 9 參考文獻47-52
• 附錄52-53
• 致謝53-54
• 綜述54-63
• 參考文獻62-63

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本文編號：399577