發(fā)布時間：2017-05-27 10:04

  本文關(guān)鍵詞：磷酸化修飾對HSF4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 白內(nèi)障是由于眼球晶狀體的部分或全部渾濁化所導(dǎo)致的視力下降�？煞譃樵绨l(fā)型（先天性）白內(nèi)障和遺傳性白內(nèi)障。先天性白內(nèi)障是指出生后一年內(nèi)出現(xiàn)的晶狀體渾濁，是兒童視力喪失的主要原因之一。先天性白內(nèi)障的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖隱性遺傳等，其中以常染色體顯性遺傳性先天性白內(nèi)障（ADCC）為主。 到目前為止，通過對一系列ADCC家族進(jìn)行基因連鎖分析，對先天性白內(nèi)障的遺傳背景有了更加詳細(xì)的了解，約有40多個遺傳位點和常染色體顯性先天性白內(nèi)障有關(guān)，按照其編碼蛋白功能，與人類ADCC有關(guān)的基因分一下四類：晶狀體蛋白基因，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因，細(xì)胞骨架蛋白基因和膜轉(zhuǎn)運蛋白基因。其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因中的HSF4有很重要的作用，對其研究亦有所進(jìn)步，它在晶狀體纖維細(xì)胞的生長和成熟等過程中起著重要作用，但是其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制還不清楚。近年來發(fā)現(xiàn)與白內(nèi)障有關(guān)的突變位點的數(shù)量已超過100個。在人體內(nèi)，通過對一系列ADCC家族進(jìn)行基因連鎖分析發(fā)現(xiàn)均存在HSF4b基因的錯義突變。在小鼠，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)敲除小鼠的HSF4基因，新生小鼠出生后3-5天即出現(xiàn)白內(nèi)障，可能與晶狀體纖維細(xì)胞分化和發(fā)育異常有關(guān)。 HSF4是HSFs即熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族的一個成員，它在外界和內(nèi)環(huán)境等的刺激或者正常生理狀態(tài)下都可形成三聚體，然后和熱休克元件（HSE）結(jié)合，激活下游HSP27、HSP70、HSP90以及晶狀體蛋白等的表達(dá)。HSF4分兩不同亞型：HSF4a和HSF4b。前者有轉(zhuǎn)錄抑制活性，而后者具有轉(zhuǎn)錄激活和抑制雙重作用。HSF4b是晶狀體內(nèi)特異表達(dá)的亞型。小鼠晶狀體HSF4b的缺失降低Hsp25，γ-crystallin和CP49等蛋白的表達(dá)。 磷酸化是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾之一，，在細(xì)胞信號的傳遞過程中占有極其重要的地位，HSF4b在生理條件下即可處于磷酸化狀態(tài)，也可以受MAP激酶調(diào)控發(fā)生磷酸化修飾，即HSF4b受P38、JNK和ERKl/2的磷酸化調(diào)控發(fā)生磷酸化，磷酸化后激活其下游熱休克蛋白表達(dá)，磷酸化可誘導(dǎo)HSF4b類泛素化，SUM0反過來抑制了HSF4b體外轉(zhuǎn)錄活性。HSF4中含有一個PDSM（磷酸化依賴SUMO化修飾基序）模體，PDSM存在于保守兩個功能不同的熱休克因子家族成員HSF1和HSF4b中間，與SUMO相似，PDSM通過磷酸化依賴SUMO化，發(fā)過來抑制了底物的轉(zhuǎn)錄活性。HSF4b中的S299絲氨酸處于PDSM模體PASP中，因此我們推測該位點磷酸化后能反過來抑制HSF4b的轉(zhuǎn)錄活性。 14-3-3與靶蛋白結(jié)合時主要通過識別靶蛋白中的磷酸化絲氨酸/蘇氨酸識別序列。根據(jù)這些序列模體可以推測某些蛋白質(zhì)能否和14-3-3蛋白結(jié)合，S299位點存在含有絲氨酸的模體，我們猜測它是否與14-3-3相互作用。下一步實驗既是利用三個突變體分別與14-3-3共轉(zhuǎn)染觀察它們的結(jié)合作用，結(jié)合下游蛋白的表達(dá)量來分析該位點磷酸化后對HSF4b的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)。 為了進(jìn)一步了解控制HSF4b轉(zhuǎn)錄活性的分子機制，我們就磷酸化調(diào)控HSF4b的機制進(jìn)行探討，預(yù)測可能的蛋白序列磷酸化位點,將其定點突變進(jìn)行功能研究和機制研究，找到相應(yīng)的磷酸化激酶和通路。 本實驗通過構(gòu)建HSF4b的突變體，測定HSF4b的轉(zhuǎn)錄活性，確定有效的磷酸化位點以及對下游相關(guān)基因的調(diào)控。 目的 本研究通過構(gòu)建HSF4b的突變體，測定HSF4b的轉(zhuǎn)錄活性，確定有效的磷酸化位點以及HSF4b下游相關(guān)基因的調(diào)控。 方法 1.應(yīng)用PCR技術(shù)，利用突變引物擴增PWZL-blast-HSF4b(以下簡稱HSF4b)，產(chǎn)物用DpnⅠ酶切，轉(zhuǎn)化至DH5α中，提取質(zhì)粒，ECORⅠ初步酶切鑒定，測序。 2.測序證確后，將上述突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行真核表達(dá)。利用SDS-PAGE和Western blot實驗鑒定HSF4b和Hsp27蛋白的表達(dá)，初步確定有效的磷酸化位點。 3.利用HSF4b缺失的晶狀體上皮細(xì)胞（MLEC-/-），轉(zhuǎn)染突變體質(zhì)粒，建立穩(wěn)定株MLEC HSF4b、MLEC HSF4b/S299A、MLEC HSF4b/S299D和MLEC HSF4b/S299E。Western blot實驗鑒定HSF4b和Hsp27，alpha B-crystallin等蛋白的表達(dá)。 4.通過luciferase assay實驗，來驗證HSF4b/S299A,HSF4b/S299D, HSF4b/S299E對下游基因α B-晶體蛋白（alpha B-crystallin）的影響。 結(jié)果 1.構(gòu)建了HSF4b的突變質(zhì)粒HSF4b/S42A、HSF4b/S49A、HSF4b/S66A、HSF4b/S85A、HSF4b/T173A、HSF4b/T221A、HSF4b/S243A、HSF4b/S269A、HSF4b/S278A、HSF4b/S299A、HSF4b/S340A、HSF4b/S372A、HSF4b/S401A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A、HSF4b/S489A、HSF4b/S299D和HSF4b/S299E共18個，測序正確。 2.將上述突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blot實驗鑒定體內(nèi)Hsp27蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示：HSF4b/S66、AHSF4b/S269A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A的Hsp27表達(dá)降低，HSF4b/S299A的Hsp27表達(dá)升高，其他突變體無明顯變化。 3.成功建立了穩(wěn)定株MLEC/HSF4b、MLEC/HSF4b/S299A、MLEC/HSF4b/S299D和MLEC/HSF4b/S299E三個，Western blot實驗證明S299是有效的磷酸化位點，起到了表達(dá)抑制作用。 4. Luciferase assay說明了S299A對HSF4b下游αB-晶體蛋白（alpha B-crystallin）有轉(zhuǎn)錄激活作用，HSF4b/S299D和HSF4b/S299E對HSF4b下游基因alpha B-crystallin有轉(zhuǎn)錄抑制作用。 結(jié)論 1.成功建立了HSF4b表達(dá)突變體18個。 2.初步確定了5個有效磷酸化位點，其中HSF4b/S66A、HSF4b/S269A、HSF4b/T446A、HSF4b/T471A表現(xiàn)為對下游基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，HSF4b/S299A表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：熱休克轉(zhuǎn)錄因子4 定點突變 熒光素酶實驗
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 英文縮略詞表(ABBREVIATION)12-13
• 引言13-15
• 1 前言15-17
• 2 材料、試劑與儀器17-27
• 2.1 菌種、載體、細(xì)胞來源17
• 2.2 主要試劑17
• 2.3 主要溶液17-25
• 2.4 實驗儀器25-27
• 3 方法27-37
• 3.1 引物設(shè)計27-28
• 3.2 PCR 克隆 PWZL-blast-HSF4b 突變體基因全長28-29
• 3.3 PCR 產(chǎn)物酶切29
• 3.4 制備感受態(tài)細(xì)胞與轉(zhuǎn)化29-30
• 3.5 鑒定克隆30
• 3.6 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染30-31
• 3.7 穩(wěn)定株的建立31-32
• 3.8 細(xì)胞收集并裂解32
• 3.9 BCA 法測定各細(xì)胞總蛋白濃度32-33
• 3.10 Western blot 實驗方法33-34
• 3.11 Luciferase assay 實驗方法34-37
• 4 實驗結(jié)果37-51
• 4.1 PWZL-blast-HSF4b 突變體基因全長的擴增37-39
• 4.2 突變體的酶切鑒定39-42
• 4.3 突變體的測序鑒定42-46
• 4.4 Western blot 結(jié)果46-49
• 4.5 luciferase assay 結(jié)果49-51
• 5 討論51-55
• 小結(jié)55-57
• 參考文獻(xiàn)57-59
• 綜述59-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 致謝69-71

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 章文賢;蔣詠梅;賀望興;郭文燕;黃曉菊;鄭素云;;靈芝14-3-3蛋白基因的電子克隆與表達(dá)分析[J];華北農(nóng)學(xué)報;2013年05期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張晶;新型疫苗佐劑—硫酸乙酰肝素刺激DCs后差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 王澤英;Clusterin基因在奶牛乳腺炎中的作用及表達(dá)調(diào)控機制[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：磷酸化修飾對HSF4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：399576