本文關(guān)鍵詞：鋅指蛋白Apak的表達與腫瘤相關(guān)性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 KZNF蛋白是哺乳動物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族,它的蛋白結(jié)構(gòu)中包括KRAB結(jié)構(gòu)域和多個鋅指結(jié)構(gòu)。鋅指結(jié)構(gòu)近似一個手型，可以與目的基因特異結(jié)合，一個鋅指結(jié)構(gòu)可以與3~4核苷酸相互作用，不同鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合的DNA序列不同。KRAB結(jié)構(gòu)域能夠募集組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙酰化酶、異染色質(zhì)蛋白等抑制細胞轉(zhuǎn)錄。KZNF蛋白通過鋅指結(jié)構(gòu)與靶基因結(jié)合，再通過KRAB結(jié)構(gòu)域抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，參與細胞生命活動的調(diào)控。KZNF蛋白具有抑制RNA聚合酶I、II和III引物的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控核仁功能，結(jié)合與剪接RNA的功能。 Apak蛋白是本實驗室發(fā)現(xiàn)與研究的一種KZNF蛋白，由ZNF420基因編碼，是抑癌蛋白p53的負調(diào)控分子。在正常細胞中，Apak通過輔抑制蛋白KAP1聚集組蛋白去乙�；窰DAC1和ATM激酶與p53結(jié)合形成復合體，使p53的乙酰化水平下調(diào)，抑制p53相關(guān)的凋亡靶基因表達，抑制細胞凋亡，而對p53參與的其它生理功能沒有明顯的調(diào)控作用。在烷化劑MMS誘導的DNA損傷情況下，ATM被激活，Apak的Ser68位點發(fā)生磷酸化，磷酸化狀態(tài)的Apak與p53解離，解除了對p53的抑制作用，p53激活，細胞凋亡。 目的 探討作為KZNF家族的Apak蛋白是否有不依賴于p53的其它作用機制，Apak蛋白對細胞生長增殖有什么作用，Apak蛋白的表達與腫瘤有怎樣的相關(guān)性，希望為腫瘤的早期診斷和防治提供新的預警分子。 方法 本實驗采取病例對照研究設(shè)計，選取15例胃癌患者和20例結(jié)直腸癌患者腫瘤樣本作為病例組，同一患者的腫瘤旁正常組織作為對照組，采用Westernblotting方法檢測腫瘤組織中Apak蛋白的表達水平。培養(yǎng)H1299細胞，轉(zhuǎn)染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四種質(zhì)粒，采用實時熒光定量PCR的方法檢測rRNA的水平，采用流式細胞檢測細胞周期，采用MTT方法檢測細胞增殖，采用ChIP方法檢測與Apak蛋白結(jié)合的DNA序列，并對結(jié)果進行分析。 結(jié)果 1、對本實驗人群中的15例胃癌患者及20例結(jié)直腸癌患者的組織標本，采用Western blotting方法檢測Apak蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)對于同一患者，與腫瘤旁正常組織相比，腫瘤組織中Apak蛋白水平下調(diào)，并且，p53突變的細胞中，Apak蛋白下調(diào)水平更顯著，說明Apak蛋白在腫瘤組織中有不依賴于p53的其它作用機制。 2、分四個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)H1299細胞，分別轉(zhuǎn)染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48小時后，收細胞，提取細胞RNA，利用實時熒光定量PCR檢測rRNA的表達水平，利用Western blotting方法檢測Apak蛋白的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apak蛋白能夠抑制rRNA的合成。 3、分兩個培養(yǎng)瓶培養(yǎng)H1299細胞，分別轉(zhuǎn)染GFP-C3，GFP-Apak兩種質(zhì)粒，48小時候后收細胞，使用流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Apak蛋白使大部分H1299細胞在G1期阻滯。 4、在H1299細胞中，分別轉(zhuǎn)染GFP-C3，GFP-Apak，shRNA-con，shRNA-Apak四種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后，G418處理，2~3周后獲得穩(wěn)定表達Apak和穩(wěn)定敲低Apak的細胞系，利用MTT方法檢測細胞的增殖，，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apak蛋白抑制細胞生長。 5、利用染色質(zhì)免疫沉淀方法（ChIP）發(fā)現(xiàn)Apak能夠與45SpreRNA的調(diào)控區(qū)結(jié)合，其結(jié)合的DNA序列是TCTTN2-30TTGT。 6、設(shè)置三個實驗組，每組含有兩瓶分別轉(zhuǎn)染了shRNA-con和shRNA-Apak質(zhì)粒的H1299細胞，第一組作為對照組，不加任何藥劑；第二組加入TSA；第三組加入5’-Aza，一段時間后收細胞，提取細胞RNA，利用實時熒光定量PCR檢測preRNA的水平。結(jié)果表明Apak能夠使rRNA調(diào)控區(qū)發(fā)生甲基化，即Apak對rRNA調(diào)控區(qū)存在表觀遺傳學修飾。 結(jié)論 1、在腫瘤組織中Apak蛋白水平下調(diào)，并且，p53突變的細胞中，Apak蛋白下調(diào)水平更顯著。 2、Apak蛋白能夠與45SpreRNA的調(diào)控區(qū)結(jié)合。 3、Apak蛋白能夠使rRNA調(diào)控區(qū)發(fā)生甲基化，即Apak對rRNA調(diào)控區(qū)存在表觀遺傳學修飾。 4、Apak蛋白能夠抑制rRNA的合成。 5、Apak蛋白能夠抑制細胞增長，使細胞在G1期阻滯。
【關(guān)鍵詞】：KZNF Apak p53 腫瘤 KRAB 鋅指蛋白
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 實驗材料與方法12-24
• 1 實驗材料與儀器12-16
• 2 實驗方法16-24
• 第三章 實驗結(jié)果24-32
• 第四章 小結(jié)32-33
• 第五章 討論33-35
• 參考文獻35-38
• 文獻綜述38-43
• 參考文獻41-43
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章43-44
• 致謝44-45

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本文編號：395133