目的：篩選能分泌抗人AFP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并以其為原料構(gòu)建抗人AFP單鏈抗體(ScFv)基因，并將基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)，分離純化抗人AFP ScFv抗體，并鑒定其活性。方法：利用GENEDOC軟件對人AFP及HSA氨基酸序列進(jìn)行同源比較。用ELISA及斑點(diǎn)印跡方法從已有的雜交瘤細(xì)胞株中篩選與人血清白蛋白無交叉反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，根據(jù)小鼠IgG V區(qū)骨架區(qū)保守序列合成通用引物，擴(kuò)增VH上游引物5端和擴(kuò)增VL下游引物5`端加入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，擴(kuò)增VH下游引物5端和擴(kuò)增VL上游引物5`端加入連接肽堿基序列，兩者有18個堿基互補(bǔ)。用RNA提取試劑和提取雜交瘤細(xì)胞總RNA，用RT-PCR方法，分別分離純化VH和VL基因片段。用重疊延伸PCR方法將VH和VL連接在一起，構(gòu)建ScFv基因。將ScFv基因克隆至pGEM-T載體，構(gòu)建重組pGEM-A質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶切、PCR和測序鑒定。用限制性內(nèi)切酶雙酶切pGEM-A和大腸桿菌TrxA融合蛋白表達(dá)pET32(a+)質(zhì)粒載體，將從pGEM-A質(zhì)粒上酶切獲得的ScFv基因克連接到pET...

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖1一3斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2特異性鑒定:3.2.1雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1一2。、、月尹8氣l一]尸、S.。石O2O4lP、洲r(nóng)二一︸A矛rt、3，2:牛血清白蛋白3，5:4:人血清白蛋白6:羊抗鼠IgG一HRP標(biāo)記，2:BSA3，5:抗體7:兔抗牛血清白蛋白抗體AFP4:HSA6:sheePanti一....

圖2一3:RT一PCR擴(kuò)增的VH和VL基因

結(jié)果3.1RNA提取結(jié)果圖2一2從4H5DI細(xì)胞中提取的總RNAFigZ一2ThetotalRNAof4H5DIeellline提取RNA有三條帶明顯，285，185和5s，RNA無降解。3.2RT一PCR擴(kuò)增VH和VL結(jié)果2000bP1000bP750bP500bP250bP1....

圖2一4VH和VL連接后的ScFv基因FigZ一4:TheScFvgenethatlegatedbySOEPCR

100bPA，B:PCRC，D:EeoRI+XhoIM:DL2000Marker圖2一5酶切和PCR鑒定結(jié)果FigZ一5TheresultofdoubleendonueleasesdigestedandPCRPcR和酶切均獲得了750bP左右大小的條帶，說明ScFv基因成功克隆入....

圖2一5酶切和PCR鑒定結(jié)果

100bPA，B:SeFvgeneM:DL2000Marker圖2一4VH和VL連接后的ScFv基因FigZ一4:TheScFvgenethatlegatedbySOEPCR經(jīng)sOE一pCR拼接后，獲得的seFv抗體基因大約75obp左右。3.4酶切及PCR鑒定結(jié)果1000bP7....

本文編號：3949882