高血壓病(Hypertension, HTN)是一種以動脈血壓持續(xù)偏高為主要表現(xiàn)的慢性疾病,常伴有脂肪和糖代謝紊亂以及心、腦、腎和視網(wǎng)膜等器官組織的不良重塑,其腦卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性腎臟病等主要并發(fā)癥,致殘、致死率高。據(jù)報道,目前全球約有10億高血壓患者,每年有近800萬人死于由高血壓引起的各種疾病,我國有高血壓患者至少2億,每年新增患者約1000萬人。目前治療高血壓主要是通過藥物治療,包括α-受體阻滯劑類,鈣通道阻斷劑類,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類,血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類等。雖然藥物治療療效明顯,但由于患者服藥依從性差,藥物引起的毒副作用以及機(jī)體產(chǎn)生耐藥性等原因,導(dǎo)致目前高血壓控制率不高,因此世界各國心血管基礎(chǔ)研究和臨床工作者都在積極探索新的治療方法和手段,而開發(fā)高效、安全的疫苗成為治療和控制高血壓病的一個新的研究方向。 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(The renin-angiotensin-aldosteron system, RAAS)過度激活是目前研究的最為清楚,也是最為重要的高血壓發(fā)病機(jī)制,在RAAS中,過多的血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)通...

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【學(xué)位級別】：博士

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目錄
摘要
Abstract
前言
第一部分 攜帶P1-2A-4AngⅡs和3ABC基因的重組桿狀病毒載體的構(gòu)建及鑒定
    一、實(shí)驗(yàn)材料與方法
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 基因、質(zhì)粒、菌株、Bac-to-Bac重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和細(xì)胞
            1.2 工具酶及試劑
            1.3 主要儀器
            1.4 引物
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 4AngⅡs基因的獲得及保存
                2.1.1 4AngⅡs基因的獲得
                2.1.2 4AngⅡs基因的保存
            2.2 重組質(zhì)粒pT7-18f-2A-4AngⅡs的構(gòu)建及鑒定
                2.2.1 4AngⅡs基因片段的獲得
                2.2.2 載體質(zhì)粒pT7-18f基因片段的獲得
                2.2.3 連接4AngⅡs基因片段和載體pT7-18f基因片段
                2.2.4 重組質(zhì)粒pT7-18f-4AngⅡs的獲得及鑒定
            2.3 重組供體質(zhì)粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的構(gòu)建及鑒定
                2.3.1 目的基因P1-2A-4AngⅡs和3ABC的克隆
                2.3.2 將P1-2A-4AngⅡs基因片段克隆至pFastbac-Dual質(zhì)粒中
                2.3.3 將3ABC基因片段克隆至重組質(zhì)粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs中
                2.3.4 重組供體質(zhì)粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鑒定
            2.4 重組桿粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的構(gòu)建及鑒定
                2.4.1 制備E.coli DH10感受態(tài)細(xì)胞
                2.4.2 重組供體質(zhì)粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC轉(zhuǎn)化E.coli DH10
                2.4.3 重組桿粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的提取
                2.4.4 重組桿粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鑒定
            2.5 Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)
                2.5.1 Grace完全培養(yǎng)基的配制
                2.5.2 Sf9細(xì)胞傳代培養(yǎng)
                2.5.3 Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)條件
            2.6 重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的包裝和擴(kuò)增
                2.6.1 重組桿粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞
                2.6.2 重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的收獲及傳代
            2.7 重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的鑒定
                2.7.1 重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC基因組的提取
                2.7.2 PCR方法鑒定重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC
                2.7.3 重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC顆粒的形態(tài)學(xué)觀察
            2.8 重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC病毒滴度的測定
    二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        1. 重組質(zhì)粒pT7-18f-2A-4AngⅡs的構(gòu)建及鑒定
        2. 重組供體質(zhì)粒pFastbac-Dual-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的構(gòu)建及鑒定
        3. 重組桿粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC的構(gòu)建及鑒定
        4. Bacmid-GFP轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后熒光生成情況
        5. 重組桿粒Bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后的細(xì)胞形態(tài)變化情況
        6. PCR驗(yàn)證重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC
        7. 透射電鏡下觀察重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)
        8. 蝕斑實(shí)驗(yàn)測定重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC病毒滴度
    三、討論
第二部分 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的表達(dá)、鑒定及免疫原性和治療效果分析
    一、實(shí)驗(yàn)材料和方法
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC和細(xì)胞
            1.2 實(shí)驗(yàn)動物
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
            1.5 引物
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 Sf9細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)
                2.1.1 Grace完全培養(yǎng)基的配制
                2.1.2 Sf9細(xì)胞的凍存
                2.1.3 Sf9細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)
                2.1.4 Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)條件
                2.1.5 Sf9細(xì)胞計數(shù)
                2.1.6 Sf9細(xì)胞活性測定
            2.2 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的表達(dá)及鑒定
                2.2.1 重組桿狀病毒Bav-P1-2A-4AngⅡs-3ABC感染sf9細(xì)胞
                2.2.2 RT-PCR
                2.2.3 目的蛋白pHAV-4AngⅡs樣品的制備和SDS-PAGE凝膠電泳
                2.2.4 Western blot
                2.2.5 間接免疫熒光
                2.2.6 透射電鏡下觀察目的蛋白pHAV-4AngⅡs的VLP結(jié)構(gòu)
            2.3 目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表達(dá)條件的摸索
                2.3.1 Western blot確定目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表達(dá)條件
                2.3.2 ELISA確定目的蛋白pHAV-4AngⅡs最佳表達(dá)條件
            2.4 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的純化和鑒定
                2.4.1 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的大量制備及純化
                2.4.2 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的鑒定
                2.4.3 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的濃度測定
            2.5 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的免疫原性和治療效果分析
                2.5.1 實(shí)驗(yàn)動物
                2.5.2 免疫方案
                2.5.3 血清的處理及保存
                2.5.4 血壓的測量
                2.5.5 抗AngⅡ抗體滴度的測定
                2.5.6 血清中AngⅡ含量的測定
                2.5.7 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析
    二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        1. 細(xì)胞計數(shù)
        2. 細(xì)胞病變
        3. RT-PCR
        4. SDS-PAGE和Western blot
        5. 間接免疫熒光
        6. 透射電鏡下觀察目的蛋白pHAV-4AngⅡs的VLP結(jié)構(gòu)
        7. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的最佳表達(dá)時間和MOI值
        8. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs的純化和鑒定
        9. 血壓測定
        10. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs免疫大鼠后抗體滴度的測定與分析
        11. 目的蛋白pHAV-4AngⅡs免疫大鼠后血清中抗原AngⅡ的濃度的測定與分析
        12. 血壓值、抗體滴度和AngⅡ水平之間的兩兩相關(guān)性分析
            12.1 血壓值和抗體滴度相關(guān)性分析
            12.2 血壓值和AngⅡ水平相關(guān)性分析
            12.3 抗體滴度和AngⅡ水平相關(guān)性分析
    三、討論
小結(jié)
展望
參考文獻(xiàn)
附錄
論文綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
研究生簡歷



本文編號：3950231