本文關(guān)鍵詞：采用噬菌體肽庫篩選Rh（D）血型抗原模擬表位及其鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的用人源純化的混合抗Rh（D）多克隆抗體篩選噬菌體肽庫，從中尋找到Rh（D）血型抗原的模擬表位，為研制針對Rh（D）血型不合新生兒溶血�。≧hD-Hemolyticdisease of newborn, RhD-HDN）的新型診斷抗原、制備特異疫苗以及探索新的治療方法提供實驗基礎(chǔ)。 方法1.收集5例經(jīng)不規(guī)則抗體篩查為陽性并鑒定含抗Rh（D）抗體的Rh（D）陰性者血清，經(jīng)等比例混合后，分別用RhD（-）A型、RhD（-）B型壓積紅細(xì)胞對血清中的抗A、抗B抗體于4℃過夜吸收處理；滲透濃度為30mmol/L的PB作為裂解液,將遺傳表現(xiàn)型為CCDee的RhD陽性O(shè)型紅細(xì)胞制備成血影細(xì)胞,觀察其抗原性；以血影細(xì)胞作為抗原，吸附血清中抗Rh（D）抗體，再用低pH值緩沖液洗脫、分離純化抗Rh（D）抗體，，用DEAE-Sephadex A-50層析法提取其中免疫球蛋白G（Immunoglobulin G, IgG）組分；用western blot鑒定條帶成分，微柱法測抗Rh（D）抗體效價。 2.用純化的多克隆抗Rh（D）抗體對噬菌體隨機(jī)十二肽庫進(jìn)行三輪吸附-洗脫-擴(kuò)增過程篩選，計算每輪的富集率；酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay, ELISA）法檢測每輪篩選后洗脫物與抗Rh（D）抗體的結(jié)合情況；ELISA法檢測隨機(jī)挑取的第三輪篩選后滴度測定平板上的26個噬菌體克隆與抗Rh（D）抗體結(jié)合情況；對ELISA法檢測中A450值高于0.5的16個噬菌體克隆進(jìn)行陽性噬菌體克隆的初篩實驗，逐一檢測每個噬菌體克隆與抗體的結(jié)合力；提取陽性克隆DNA并進(jìn)行測序，推導(dǎo)外源多肽的氨基酸序列。凝集抑制實驗檢測噬菌體展示的多肽對Rh（D）血型抗原結(jié)合的模擬作用。 結(jié)果 1.5例血清中均含抗Rh（D）抗體，微柱法檢測混合血清抗Rh（D）抗體效價為32；混合血清中的抗A和抗B血型抗體被完全吸收，吸收后血清中的抗A和抗B效價均＜2；制備的血影細(xì)胞保持了較強(qiáng)的抗原性；純化后抗Rh（D）抗體IgG組分效價達(dá)到32。 2.三輪篩選后，富集率從（4.45×10-6）%增加到（4.27×10-5）%；隨著篩選輪數(shù)增加，噬菌體洗脫物與抗Rh（D）抗體的結(jié)合力逐漸增強(qiáng)；第三輪篩選后26個噬菌體克隆與抗Rh（D）抗體具有不同的結(jié)合力，其中2,8,12,17,21,22克隆與抗Rh（D）抗體呈高親和力結(jié)合；初篩實驗中洗脫的噬菌體滴度測定顯示克隆2,8,12,17,21,22在與抗體結(jié)合后的洗脫物中含量較高，并且與牛血清白蛋白（BSA）反應(yīng)結(jié)合后的洗脫物中含量很低；上述6個陽性克隆中4個噬菌體克隆DNA序列一致：5-CCGAGCCAGGGGTACGTGATACTGCTGGACGAGAAG-3，展示相同的氨基酸序列（PSQGYVILLDEK），命名為C2；另外2個噬菌體克隆DNA序列一致：5'-ACAATGTTAAATCGTGCTCATGATTTTTCTGAATGT-3'，展示相同的氨基酸序列（TMLNRAHDFSEC），命名為C21。凝集抑制實驗結(jié)果表明展示這兩個多肽的噬菌體可以抑制Rh（D）抗原陽性紅細(xì)胞的凝集作用。 結(jié)論 1.本實驗純化了抗Rh（D）多克隆抗體，并獲得了高效價的抗Rh（D）抗體的IgG組分，為下一步利用噬菌體肽庫獲得Rh（D）血型抗原模擬表位研究奠定基礎(chǔ)。 2.多肽PSQGYVILLDEK和TMLNRAHDFSEC可以模擬Rh（D）血型抗原表位，具有建立針對RhD-HDN的新型診斷抗原和制備特異疫苗的潛能。
【關(guān)鍵詞】：抗Rh（D）抗體 純化 噬菌體隨機(jī)肽庫 模擬表位 Rh（D）血型抗原
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英文縮略語表6-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 1 前言12-13
• 2 材料與方法13-30
• 2.1 實驗材料、儀器、試劑配制13-21
• 2.2 方法21-30
• 3 結(jié)果30-38
• 3.1 5 例 RhD 陰性者血清不規(guī)則抗體篩查及效價測定結(jié)果30-31
• 3.2 混合血清抗 Rh（D）抗體效價31
• 3.3 抗 A 和抗 B 效價31-32
• 3.4 血影細(xì)胞的形態(tài)和抗原性檢測32-33
• 3.5 多克隆抗 Rh（D）抗體的 Western blot 鑒定33-34
• 3.6 純化后多克隆抗 Rh（D）抗體的效價34
• 3.7 噬菌體肽庫篩選的富集率34
• 3.8 噬菌體的 ELISA 檢測34-36
• 3.9 陽性噬菌體克隆的初篩實驗36
• 3.10 陽性噬菌體克隆的測序分析36-37
• 3.11 噬菌體凝集抑制實驗37-38
• 4 討論38-40
• 4.1 38-39
• 4.2 39-40
• 5 結(jié)論40-42
• 5.1 40-41
• 5.2 41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 附錄46-47
• 致謝47-48
• 綜述48-54
• 參考文獻(xiàn)52-54

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本文編號：393446