本文關(guān)鍵詞：阿片肽及其受體對離體人表皮干細胞增殖遷移的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 皮膚創(chuàng)面修復(fù)是創(chuàng)傷治療學(xué)中的重要環(huán)節(jié),創(chuàng)面愈合是多種細胞和細胞因子共同參與的復(fù)雜過程,其中一個基本條件是創(chuàng)面的再上皮化(re-epithelization),即表皮細胞從創(chuàng)緣或殘留的表皮細胞島向創(chuàng)面中心增殖分化以覆蓋創(chuàng)面而完成修復(fù)過程。皮膚再上皮化的過程中,人表皮干細胞(human Epidermal Stem Cells, hESCs)擔(dān)任著十分重要的角色。 表皮干細胞是皮膚組織的特異性干細胞,來源于胚胎的外胚層,有較原始的分化能力,具有非成熟細胞的特征,即細胞體積小、細胞器少、處于靜止狀態(tài),主要位于皮膚的基底細胞層以及毛囊外根鞘隆突部。表皮干細胞因為具有自我更新和強大的增殖潛能,故被認為是皮膚組織工程理想的種子細胞。表皮干細胞是各種表皮細胞的祖細胞,具有雙向分化的能力�？上蛳逻w移分化形成表皮基底層,進而形成毛囊,又能向上分化為表皮細胞,對皮膚損傷修復(fù)及毛囊的生長起關(guān)鍵作用。 近年來,關(guān)于成體干細胞功能受生長因子、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等因素調(diào)節(jié)的研究已得到大家的廣泛認同,而神經(jīng)肽對各種干細胞的調(diào)控作用已成為近來研究的重點。阿片肽屬于神經(jīng)肽類一種,其與受體廣泛存在于人體各組織器官,介導(dǎo)多條信號通路的傳導(dǎo),并調(diào)節(jié)諸多生理功能。 已被提出的體內(nèi)阿片受體共有μ、K、δ、σ、ε5種,但較為公認的有3種,即u型受體(mu-opioid receptor, MOR)、K型受體(kappa-opioid receptor, KOR)和δ型受體(delta-opioid receptor, DOR)。 目前有研究顯示,三種阿片受體在表皮干細胞上均有表達,并參與組織的愈合、角質(zhì)形成細胞的增殖和分化。當(dāng)皮膚遭受創(chuàng)傷后,角質(zhì)形成細胞強表達阿片受體而且產(chǎn)生各種細胞因子。MOR的配體β-內(nèi)啡呔(beta-endorphin)刺激角質(zhì)形成細胞的遷移活動,但是KOR的配體強啡肽(Dynorphin)在同樣的條件下只有極小的作用。阿片肽受體的拮抗劑納絡(luò)酮(naltrexone)能明顯減少β-內(nèi)啡呔對角質(zhì)形成細胞的遷移作用。總之,無論是離體實驗,還是在體情況下,均有證據(jù)表明,阿片肽調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞的分化參與創(chuàng)面的再上皮化過程。 近年來的研究發(fā)現(xiàn),正常大鼠皮膚組織內(nèi)β-內(nèi)啡肽和u型阿片受體主要分布于真、表皮交界的周圍神經(jīng)末梢及部分表皮的角質(zhì)形成細胞和真皮的成纖維細胞中。皮膚組織燒傷即刻β-內(nèi)啡肽的表達增多,隨后μ型阿片受體的表達增強,至創(chuàng)面完全愈合,β-內(nèi)啡肽的表達恢復(fù)正常水平,但u型阿片受體仍有表達。說明燒傷愈合過程中β-內(nèi)啡肽和μ型阿片受體的表達具有一定的時空特性,是參與影響創(chuàng)面愈合的因素之一。但是到目前為止,阿片肽及其受體系統(tǒng)在皮膚組織的代謝和創(chuàng)面愈合中的具體作用機制及其在表皮干細胞的增殖、遷移與分化中的作用尚不明確。 目的： 1、分離培養(yǎng)人表皮干細胞(epidermal stem cells, ESCs)并對其進行鑒定,了解其體外正常生長情況,為表皮干細胞的相關(guān)研究儲備種子細胞。 2、觀察三種阿片受體mu型(μ-opioid receptor, MOR)、kappa型(κ-opioid receptor, KOR)和delta型(δ-opioid receptor, DOR)的活化和抑制對體外培養(yǎng)的人表皮干細胞增殖與遷移能力的影響。 方法： 1、人表皮干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。取自愿捐贈的新鮮青年包皮標本,去除皮下組織,PBS洗3次,加入0.25%Dispase II5ml于4℃過夜；分離并剪碎表皮,置于含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶中消化10min,加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化,吹打成單細胞懸液,200目濾網(wǎng)過濾。1000r/min,離心5min,棄上清,加入表皮干細胞培養(yǎng)基(K-SFM,30μg/ml BPE,5ng/ml hEGF)重懸細胞,接種至預(yù)先用Ⅳ型膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶中,靜置l0min,顯微鏡下觀察部分細胞已貼壁,吸出全部培養(yǎng)基及未貼壁細胞,加入新鮮培養(yǎng)基,于37℃、5%C02孵箱培養(yǎng),隔日換液。 收集第2代細胞,制作細胞爬片,4%多聚甲醛固定和洗滌后分別加入鼠抗人整合素β1以及鼠抗人CK19單克隆抗體,37℃孵育1h,加入FITC標記的兔抗鼠IgG(1：50)及Cy3標記的兔抗鼠IgG(1：50),37℃孵育1h,PBS洗去二抗,免疫熒光顯微鏡下觀察并拍照。制作流失細胞樣本,免疫熒光染色后,流式細胞儀檢測細胞純度。 2.阿片受體激動劑及抑制劑對hESCs增殖活性的影響：取分離培養(yǎng)的第2代hESCs,消化重懸后,按4×103/孔密度接種于用Ⅳ型膠原蛋白包被的96孔培養(yǎng)板板中。 本實驗共設(shè)7個實驗組,分為3批。 第一批：探討u型阿片受體激活或抑制對人表皮干細胞的增殖活性的影響：μ型阿片受體激動劑組(A1組)加入含lnmol/LEndorphin的K-SFM培養(yǎng)基,u型阿片受體阻斷劑組(A2組)加入含10nmol/LNaltrexone和lnmol／LEndorphin的K-SFM培養(yǎng)基,空白對照組(D組)加入單純的K-SFM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。 第二批：探討δ型阿片受體激活或抑制對人表皮干細胞的增殖活性的影響：δ型阿片受體激動劑組(B1組)加入含lnmol/L[D-Ala2, D-Leu5]-Enkephalin的K-SFM培養(yǎng)基、δ型阿片受體阻斷劑組(B2組)加入含lnmol/L Naltrindole和lnmol/L[D-Ala2, D-Leu5]-Enkephalin的K-SFM培養(yǎng)基、空白對照組(D組)加入單純的K-SFM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。 第三批：探討K型阿片受體激活或抑制對人表皮干細胞的增殖活性的影響：K型阿片受體激動劑組(C1組)加入含2nmol/L Dynorphin A的K-SFM培養(yǎng)基,K型阿片受體阻斷劑組(C2組)加入含5nmol幾5'Guanidinonaltrindoledi和2nmol/L Dynorphin A的K-SFM培養(yǎng)基,空白對照組(D組)加入單純的K-SFM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。 由加藥后開始算起,每24h各組取10個復(fù)孔做增殖情況測定。在待測定的細胞板孔中加入5mg/ml的MTT溶液,按20ul/孔加入,然后放置在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4h,取出細胞,吸干培養(yǎng)基及MTT溶液,于每孔內(nèi)加入150ul的DMSO,常溫震蕩l0min,酶標儀測定各孔吸光度值。 連續(xù)測量5天,記錄各組每天的吸光度值,并繪制細胞生長曲線。 3.阿片受體激動劑及抑制劑對hESC遷移活性的影響： 將消化好的hESCs接種于Ⅳ型膠原蛋白包被的6孔培養(yǎng)板中,各組正常培養(yǎng)至細胞鋪滿板底后,移至超凈工作臺中用滅菌200μl移液槍頭在培養(yǎng)板底部刮擦生長融合成片的單層細胞,制備寬度約為100μm的體外單層hESCs缺損模型。PBS洗去脫落細胞,更換培養(yǎng)基。 將制作的單層細胞缺損模型分為7組,每組6個復(fù)孔,具體實驗分組同上。按確定的分組方案加入含實驗藥物的K-SFM培養(yǎng)基。 顯微鏡下觀察并拍照并記錄劃痕寬度。此后每24h觀察細胞向缺損區(qū)域增殖、遷移情況,拍照記錄,共觀察96h。對拍攝的照片,采用Image-Pro Plus軟件按以下公式計算創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)面愈合率=遷移至創(chuàng)面的細胞所占面積/創(chuàng)面原始面積×100%。 結(jié)果： 1、人表皮干細胞分離培養(yǎng)結(jié)果及鑒定：分離培養(yǎng)的原代表皮干細胞呈單個或集落樣生長,3d后可見貼壁細胞出現(xiàn)克隆樣生長,7d后可見細胞呈鵝卵石樣鋪于瓶底,9-10d后見80%細胞融合,可進行傳代。取第2代人表皮干細胞經(jīng)免疫熒光染色鑒定,可見整合素β1、CK19呈陽性標記,提示分離培養(yǎng)的細胞為表皮干細胞。所有經(jīng)過流失細胞儀的細胞中,整合素β1陽性染色的細胞所占比例為(95.6±0.76)%,CK19染色陽性的細胞所占比例為(93.7±0.81)%,提示分離培養(yǎng)的細胞主要為人表皮干細胞,且細胞純度較高。 2、三種阿片受體激動劑及抑制劑對表皮干細胞分裂增殖活性的影響：經(jīng)MTT法測定各組連續(xù)5d的吸光度值,可見MOR、DOR的激活都可促進人表皮干細胞的增殖,而阻斷該受體,則表皮干細胞的增殖活性受到抑制。KOR受體對表皮干細胞的增殖活性無明顯影響,實驗數(shù)據(jù)顯示：無論激活還是阻斷KOR,表皮干細胞的增殖能力都不受影響。 3、阿片受體激動劑及抑制劑對表皮干細胞體外遷移活性的影響：表皮干細胞體外單層細胞缺損模型制備后24h,倒置相差顯微鏡下即可見各組均有表皮干細胞向創(chuàng)緣方向遷移,但MOR激動劑組越過創(chuàng)緣的細胞數(shù)多于對照組,MOR阻斷劑組少于對照組。DOR激動劑組越過創(chuàng)緣的細胞數(shù)多于對照組,DOR阻斷劑組少于對照組。而KOR激動劑組、KOR阻斷劑組與對照組比較,均無明顯差異。模型制備后72h,各組創(chuàng)面愈合率分別為,D組：81.05±0.56%,A1組：89.46±0.73%,A2組：76.10±0.32%,A1組明顯高于D組,A2組低于D組,各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；B1組：85.79±0.49%,B2組：77.23±0.54,B1組明顯高于D組,B2組低于D組,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；C1組：81.65±0.35%,C2組：80.14±0.71%,與對照組比較,三組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。模型制備后96h,各組創(chuàng)面基本完全愈合,各組間無對比意義。 結(jié)論： 1、本實驗采用中性蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶消化法分離表皮細胞,用Ⅳ型膠原蛋白快速貼壁法從皮膚細胞中分選得到純度較高的人表皮干細胞,用無血清培養(yǎng)基K-SFM培養(yǎng)細胞,見細胞生長情況良好。 采用免疫熒光染色法檢測細胞表面K19和整合素β1的陽性表達情況,來鑒定表皮干細胞,初步認為本實驗所培養(yǎng)的細胞為人表皮干細胞。 2、通過用三種阿片受體激動劑及阻斷劑來刺激人表皮干細胞,發(fā)現(xiàn)μ型阿片受體活化后可促進人表皮干細胞的分裂增殖和遷移活動,而該受體被特異性阻斷劑阻斷后,則抑制細胞的增殖和遷移；δ型阿片受體活化后也對表皮干細胞的增殖和遷移活動有促進作用,該受體被阻斷后可抑制表皮干細胞的增殖和遷移；但K型阿片受體無論被激活還是被阻斷,都對人表皮干細胞的增殖和遷移無明顯影響作用。
【關(guān)鍵詞】：阿片肽 受體 表皮干細胞 增殖 遷移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 人表皮干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定17-34
• 前言17-18
• 材料與方法18-23
• 結(jié)果23-26
• 討論26-30
• 參考文獻30-34
• 第二章 三種阿片肽及其受體對表皮干細胞增殖與遷移的影響34-55
• 前言34-36
• 材料與方法36-39
• 結(jié)果39-47
• 討論47-51
• 參考文獻51-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果55-56
• 附錄56-68
• 綜述56-68
• 參考文獻63-68
• 致謝68-69

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本文編號：393393