本文關(guān)鍵詞：阿片肽及其受體對離體人表皮干細(xì)胞增殖遷移的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 皮膚創(chuàng)面修復(fù)是創(chuàng)傷治療學(xué)中的重要環(huán)節(jié),創(chuàng)面愈合是多種細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與的復(fù)雜過程,其中一個(gè)基本條件是創(chuàng)面的再上皮化(re-epithelization),即表皮細(xì)胞從創(chuàng)緣或殘留的表皮細(xì)胞島向創(chuàng)面中心增殖分化以覆蓋創(chuàng)面而完成修復(fù)過程。皮膚再上皮化的過程中,人表皮干細(xì)胞(human Epidermal Stem Cells, hESCs)擔(dān)任著十分重要的角色。 表皮干細(xì)胞是皮膚組織的特異性干細(xì)胞,來源于胚胎的外胚層,有較原始的分化能力,具有非成熟細(xì)胞的特征,即細(xì)胞體積小、細(xì)胞器少、處于靜止?fàn)顟B(tài),主要位于皮膚的基底細(xì)胞層以及毛囊外根鞘隆突部。表皮干細(xì)胞因?yàn)榫哂凶晕腋潞蛷?qiáng)大的增殖潛能,故被認(rèn)為是皮膚組織工程理想的種子細(xì)胞。表皮干細(xì)胞是各種表皮細(xì)胞的祖細(xì)胞,具有雙向分化的能力。可向下遷移分化形成表皮基底層,進(jìn)而形成毛囊,又能向上分化為表皮細(xì)胞,對皮膚損傷修復(fù)及毛囊的生長起關(guān)鍵作用。 近年來,關(guān)于成體干細(xì)胞功能受生長因子、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等因素調(diào)節(jié)的研究已得到大家的廣泛認(rèn)同,而神經(jīng)肽對各種干細(xì)胞的調(diào)控作用已成為近來研究的重點(diǎn)。阿片肽屬于神經(jīng)肽類一種,其與受體廣泛存在于人體各組織器官,介導(dǎo)多條信號通路的傳導(dǎo),并調(diào)節(jié)諸多生理功能。 已被提出的體內(nèi)阿片受體共有μ、K、δ、σ、ε5種,但較為公認(rèn)的有3種,即u型受體(mu-opioid receptor, MOR)、K型受體(kappa-opioid receptor, KOR)和δ型受體(delta-opioid receptor, DOR)。 目前有研究顯示,三種阿片受體在表皮干細(xì)胞上均有表達(dá),并參與組織的愈合、角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化。當(dāng)皮膚遭受創(chuàng)傷后,角質(zhì)形成細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)阿片受體而且產(chǎn)生各種細(xì)胞因子。MOR的配體β-內(nèi)啡呔(beta-endorphin)刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移活動,但是KOR的配體強(qiáng)啡肽(Dynorphin)在同樣的條件下只有極小的作用。阿片肽受體的拮抗劑納絡(luò)酮(naltrexone)能明顯減少β-內(nèi)啡呔對角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移作用。總之,無論是離體實(shí)驗(yàn),還是在體情況下,均有證據(jù)表明,阿片肽調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化參與創(chuàng)面的再上皮化過程。 近年來的研究發(fā)現(xiàn),正常大鼠皮膚組織內(nèi)β-內(nèi)啡肽和u型阿片受體主要分布于真、表皮交界的周圍神經(jīng)末梢及部分表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮的成纖維細(xì)胞中。皮膚組織燒傷即刻β-內(nèi)啡肽的表達(dá)增多,隨后μ型阿片受體的表達(dá)增強(qiáng),至創(chuàng)面完全愈合,β-內(nèi)啡肽的表達(dá)恢復(fù)正常水平,但u型阿片受體仍有表達(dá)。說明燒傷愈合過程中β-內(nèi)啡肽和μ型阿片受體的表達(dá)具有一定的時(shí)空特性,是參與影響創(chuàng)面愈合的因素之一。但是到目前為止,阿片肽及其受體系統(tǒng)在皮膚組織的代謝和創(chuàng)面愈合中的具體作用機(jī)制及其在表皮干細(xì)胞的增殖、遷移與分化中的作用尚不明確。 目的： 1、分離培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells, ESCs)并對其進(jìn)行鑒定,了解其體外正常生長情況,為表皮干細(xì)胞的相關(guān)研究儲備種子細(xì)胞。 2、觀察三種阿片受體mu型(μ-opioid receptor, MOR)、kappa型(κ-opioid receptor, KOR)和delta型(δ-opioid receptor, DOR)的活化和抑制對體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞增殖與遷移能力的影響。 方法： 1、人表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。取自愿捐贈的新鮮青年包皮標(biāo)本,去除皮下組織,PBS洗3次,加入0.25%Dispase II5ml于4℃過夜；分離并剪碎表皮,置于含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶中消化10min,加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化,吹打成單細(xì)胞懸液,200目濾網(wǎng)過濾。1000r/min,離心5min,棄上清,加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基(K-SFM,30μg/ml BPE,5ng/ml hEGF)重懸細(xì)胞,接種至預(yù)先用Ⅳ型膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶中,靜置l0min,顯微鏡下觀察部分細(xì)胞已貼壁,吸出全部培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞,加入新鮮培養(yǎng)基,于37℃、5%C02孵箱培養(yǎng),隔日換液。 收集第2代細(xì)胞,制作細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定和洗滌后分別加入鼠抗人整合素β1以及鼠抗人CK19單克隆抗體,37℃孵育1h,加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1：50)及Cy3標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1：50),37℃孵育1h,PBS洗去二抗,免疫熒光顯微鏡下觀察并拍照。制作流失細(xì)胞樣本,免疫熒光染色后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度。 2.阿片受體激動劑及抑制劑對hESCs增殖活性的影響：取分離培養(yǎng)的第2代hESCs,消化重懸后,按4×103/孔密度接種于用Ⅳ型膠原蛋白包被的96孔培養(yǎng)板板中。 本實(shí)驗(yàn)共設(shè)7個(gè)實(shí)驗(yàn)組,分為3批。 第一批：探討u型阿片受體激活或抑制對人表皮干細(xì)胞的增殖活性的影響：μ型阿片受體激動劑組(A1組)加入含lnmol/LEndorphin的K-SFM培養(yǎng)基,u型阿片受體阻斷劑組(A2組)加入含10nmol/LNaltrexone和lnmol／LEndorphin的K-SFM培養(yǎng)基,空白對照組(D組)加入單純的K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 第二批：探討δ型阿片受體激活或抑制對人表皮干細(xì)胞的增殖活性的影響：δ型阿片受體激動劑組(B1組)加入含lnmol/L[D-Ala2, D-Leu5]-Enkephalin的K-SFM培養(yǎng)基、δ型阿片受體阻斷劑組(B2組)加入含lnmol/L Naltrindole和lnmol/L[D-Ala2, D-Leu5]-Enkephalin的K-SFM培養(yǎng)基、空白對照組(D組)加入單純的K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 第三批：探討K型阿片受體激活或抑制對人表皮干細(xì)胞的增殖活性的影響：K型阿片受體激動劑組(C1組)加入含2nmol/L Dynorphin A的K-SFM培養(yǎng)基,K型阿片受體阻斷劑組(C2組)加入含5nmol幾5'Guanidinonaltrindoledi和2nmol/L Dynorphin A的K-SFM培養(yǎng)基,空白對照組(D組)加入單純的K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 由加藥后開始算起,每24h各組取10個(gè)復(fù)孔做增殖情況測定。在待測定的細(xì)胞板孔中加入5mg/ml的MTT溶液,按20ul/孔加入,然后放置在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4h,取出細(xì)胞,吸干培養(yǎng)基及MTT溶液,于每孔內(nèi)加入150ul的DMSO,常溫震蕩l0min,酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值。 連續(xù)測量5天,記錄各組每天的吸光度值,并繪制細(xì)胞生長曲線。 3.阿片受體激動劑及抑制劑對hESC遷移活性的影響： 將消化好的hESCs接種于Ⅳ型膠原蛋白包被的6孔培養(yǎng)板中,各組正常培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿板底后,移至超凈工作臺中用滅菌200μl移液槍頭在培養(yǎng)板底部刮擦生長融合成片的單層細(xì)胞,制備寬度約為100μm的體外單層hESCs缺損模型。PBS洗去脫落細(xì)胞,更換培養(yǎng)基。 將制作的單層細(xì)胞缺損模型分為7組,每組6個(gè)復(fù)孔,具體實(shí)驗(yàn)分組同上。按確定的分組方案加入含實(shí)驗(yàn)藥物的K-SFM培養(yǎng)基。 顯微鏡下觀察并拍照并記錄劃痕寬度。此后每24h觀察細(xì)胞向缺損區(qū)域增殖、遷移情況,拍照記錄,共觀察96h。對拍攝的照片,采用Image-Pro Plus軟件按以下公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)面愈合率=遷移至創(chuàng)面的細(xì)胞所占面積/創(chuàng)面原始面積×100%。 結(jié)果： 1、人表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)果及鑒定：分離培養(yǎng)的原代表皮干細(xì)胞呈單個(gè)或集落樣生長,3d后可見貼壁細(xì)胞出現(xiàn)克隆樣生長,7d后可見細(xì)胞呈鵝卵石樣鋪于瓶底,9-10d后見80%細(xì)胞融合,可進(jìn)行傳代。取第2代人表皮干細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色鑒定,可見整合素β1、CK19呈陽性標(biāo)記,提示分離培養(yǎng)的細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。所有經(jīng)過流失細(xì)胞儀的細(xì)胞中,整合素β1陽性染色的細(xì)胞所占比例為(95.6±0.76)%,CK19染色陽性的細(xì)胞所占比例為(93.7±0.81)%,提示分離培養(yǎng)的細(xì)胞主要為人表皮干細(xì)胞,且細(xì)胞純度較高。 2、三種阿片受體激動劑及抑制劑對表皮干細(xì)胞分裂增殖活性的影響：經(jīng)MTT法測定各組連續(xù)5d的吸光度值,可見MOR、DOR的激活都可促進(jìn)人表皮干細(xì)胞的增殖,而阻斷該受體,則表皮干細(xì)胞的增殖活性受到抑制。KOR受體對表皮干細(xì)胞的增殖活性無明顯影響,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：無論激活還是阻斷KOR,表皮干細(xì)胞的增殖能力都不受影響。 3、阿片受體激動劑及抑制劑對表皮干細(xì)胞體外遷移活性的影響：表皮干細(xì)胞體外單層細(xì)胞缺損模型制備后24h,倒置相差顯微鏡下即可見各組均有表皮干細(xì)胞向創(chuàng)緣方向遷移,但MOR激動劑組越過創(chuàng)緣的細(xì)胞數(shù)多于對照組,MOR阻斷劑組少于對照組。DOR激動劑組越過創(chuàng)緣的細(xì)胞數(shù)多于對照組,DOR阻斷劑組少于對照組。而KOR激動劑組、KOR阻斷劑組與對照組比較,均無明顯差異。模型制備后72h,各組創(chuàng)面愈合率分別為,D組：81.05±0.56%,A1組：89.46±0.73%,A2組：76.10±0.32%,A1組明顯高于D組,A2組低于D組,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；B1組：85.79±0.49%,B2組：77.23±0.54,B1組明顯高于D組,B2組低于D組,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；C1組：81.65±0.35%,C2組：80.14±0.71%,與對照組比較,三組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。模型制備后96h,各組創(chuàng)面基本完全愈合,各組間無對比意義。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)采用中性蛋白酶聯(lián)合胰蛋白酶消化法分離表皮細(xì)胞,用Ⅳ型膠原蛋白快速貼壁法從皮膚細(xì)胞中分選得到純度較高的人表皮干細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基K-SFM培養(yǎng)細(xì)胞,見細(xì)胞生長情況良好。 采用免疫熒光染色法檢測細(xì)胞表面K19和整合素β1的陽性表達(dá)情況,來鑒定表皮干細(xì)胞,初步認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為人表皮干細(xì)胞。 2、通過用三種阿片受體激動劑及阻斷劑來刺激人表皮干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)μ型阿片受體活化后可促進(jìn)人表皮干細(xì)胞的分裂增殖和遷移活動,而該受體被特異性阻斷劑阻斷后,則抑制細(xì)胞的增殖和遷移；δ型阿片受體活化后也對表皮干細(xì)胞的增殖和遷移活動有促進(jìn)作用,該受體被阻斷后可抑制表皮干細(xì)胞的增殖和遷移；但K型阿片受體無論被激活還是被阻斷,都對人表皮干細(xì)胞的增殖和遷移無明顯影響作用。
【關(guān)鍵詞】：阿片肽 受體 表皮干細(xì)胞 增殖 遷移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 人表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定17-34
• 前言17-18
• 材料與方法18-23
• 結(jié)果23-26
• 討論26-30
• 參考文獻(xiàn)30-34
• 第二章 三種阿片肽及其受體對表皮干細(xì)胞增殖與遷移的影響34-55
• 前言34-36
• 材料與方法36-39
• 結(jié)果39-47
• 討論47-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果55-56
• 附錄56-68
• 綜述56-68
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 致謝68-69

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3 陳萌;免疫熒光雙標(biāo)法應(yīng)用于小鼠表皮干細(xì)胞分子標(biāo)記的篩選[D];山東大學(xué);2011年

4 詹日興;一氧化氮在燒傷后表皮干細(xì)胞離巢遷移中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

5 陳蘭;龜板有效成分對胎鼠表皮干細(xì)胞凋亡的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

6 朱飛濱;P物質(zhì)聯(lián)合表皮干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合與神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究[D];南昌大學(xué);2011年

7 陳季玲;急性β射線皮膚損傷創(chuàng)面及其表皮干細(xì)胞變化的實(shí)驗(yàn)研究[D];南華大學(xué);2012年

8 楊青;毛囊干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的比較研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

9 孫薇;P311促進(jìn)燒傷創(chuàng)面表皮干細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

10 方碧清;堿性成纖維細(xì)胞因子對皮膚干細(xì)胞神經(jīng)分化影響的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

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