本文關(guān)鍵詞：基于IPaH 1基因液相芯片技術(shù)快速檢測志賀氏菌的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：志賀氏菌（Shigella）是人類細(xì)菌性痢疾最常見的致病菌，嚴(yán)重威脅人類健康。目前志賀氏菌檢測方法包括常規(guī)傳統(tǒng)檢測方法（如分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)分型）、免疫學(xué)檢測方法、分子生物檢測方法。每種檢測方法均存在一定的局限性。因此開發(fā)特異、快速的志賀氏菌檢測方法在食品、藥品檢驗(yàn)、控制細(xì)菌性痢疾大規(guī)模流行等方面具有重要意義。 研究目的：以志賀氏菌侵襲性質(zhì)�？乖璈基因（IpaH）為靶基因建立液相芯片檢測系統(tǒng)，檢測模擬樣品中志賀氏菌。 研究方法：根據(jù)志賀氏菌毒力基因相關(guān)信息和引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的高特異性引物，通過PCR法檢測IPaH1基因在鮑氏志賀氏菌、野生志賀氏菌、大腸埃希氏菌、大腸桿菌（O157:H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎腸桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的表達(dá)水平，并對PCR反應(yīng)中退火溫度、引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)擴(kuò)增的IPaH1基因序列設(shè)計(jì)探針，將探針偶聯(lián)到微球上構(gòu)建液相芯片，使其可與生物素化的PCR產(chǎn)物特異性結(jié)合，優(yōu)化液相芯片檢測條件，驗(yàn)證其重復(fù)性、特異性、靈敏度，從而建立最佳的檢測方法。最后通過模擬志賀氏菌環(huán)境樣品進(jìn)行驗(yàn)證，在Luminex系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)雙重特異性檢測。 結(jié)果：通過特異性檢測，IPaH1基因在志賀氏菌中特異性表達(dá)，，而在大腸埃希氏菌、大腸桿菌（O157:H7）、腸炎沙門氏菌、阪崎、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌中不表達(dá)；PCR反應(yīng)的最適退火溫度為55.0℃~59.0℃，引物最適終濃度為0.1μM，可直接用于液相芯片的檢測。液相芯片檢測的最適條件是變性時(shí)間2min、雜交溫度54℃、雜交時(shí)間25min、孵育時(shí)間25min。重復(fù)性、特異性和靈敏度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，被測菌株的特異性達(dá)到100％，核酸靈敏度為10-6ng，菌株的靈敏度為7.8CFU/mL。模擬志賀氏菌環(huán)境樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，被測的10類22種樣品中無論是陽性組還是干擾組，熒光信號(hào)強(qiáng)度均明顯高于空白組。通過本研究中建立的液相芯片技術(shù)檢測模擬樣品的準(zhǔn)確度為100％。
【關(guān)鍵詞】：志賀氏菌 液相芯片 IPaH1基因 探針
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 緒論13-25
• 1.1 志賀氏菌研究背景13-15
• 1.2 食品中志賀氏菌檢測方法研究現(xiàn)狀15-20
• 1.2.1 常規(guī)檢測方法15-16
• 1.2.2 免疫學(xué)檢測方法16
• 1.2.3 分子生物學(xué)檢測方法16-20
• 1.3 液相芯片技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用20-24
• 1.3.1 液相芯片的工作原理21-22
• 1.3.2 液相芯片的技術(shù)性能22
• 1.3.3 液相芯片技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用22-24
• 1.4 研究的主要內(nèi)容24-25
• 第二章 志賀氏菌特異性表達(dá)檢測及 PCR 條件的確定25-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 2.1.1 菌種及來源25-26
• 2.1.2 主要儀器26-27
• 2.1.3 主要試劑27
• 2.1.4 培養(yǎng)基27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 2.2.1 菌株的培養(yǎng)28
• 2.2.2 細(xì)菌基因組 DNA 的提取28-29
• 2.2.3 DNA 濃度測定及定量29-30
• 2.2.4 特異性基因選擇及引物設(shè)計(jì)30-31
• 2.2.5 PCR 擴(kuò)增目的基因31
• 2.2.6 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-35
• 2.3.1 引物初步篩選31-32
• 2.3.2 IPaH 1 在幾種腸道致病菌的表達(dá)32-33
• 2.3.3 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化33-35
• 2.4 小結(jié)35-36
• 第三章 基于 IPaH 1 基因的液相芯片檢測志賀氏菌方法建立36-55
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料37-40
• 3.1.1 菌種及來源37-38
• 3.1.2 主要試劑及配制38-39
• 3.1.3 主要儀器39-40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-45
• 3.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì)合成40-41
• 3.2.2 微球與探針的偶聯(lián)41-42
• 3.2.3 液相芯片的質(zhì)控42-43
• 3.2.4 雜交與檢測43
• 3.2.5 雜交條件的確定43-44
• 3.2.6 液相芯片重復(fù)性驗(yàn)證44
• 3.2.7 液相芯片特異性驗(yàn)證44
• 3.2.8 液相芯片靈敏度驗(yàn)證44-45
• 3.2.9 液相芯片檢測模擬樣本45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-53
• 3.3.1 IPaH 1 液相芯片檢測雜交條件的確定45-48
• 3.3.2 IPaH 1 液相芯片檢測志賀氏菌的重復(fù)性48
• 3.3.3 IPaH 1 液相芯片檢測志賀氏菌的特異性48-49
• 3.3.4 IPaH 1 液相芯片檢測志賀氏菌的靈敏度49-52
• 3.3.5 IPaH 1 液相芯片檢測模擬樣品52-53
• 3.4 小結(jié)53-55
• 第四章 討論55-58
• 第五章 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果65-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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  本文關(guān)鍵詞：基于IPaH 1基因液相芯片技術(shù)快速檢測志賀氏菌的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：392447