本文關(guān)鍵詞：麻疹病毒N蛋白的原核表達(dá)、純化及膠體金免疫層析法的初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：麻疼是一種有高度傳染性的呼吸道疾病，我國(guó)自上世紀(jì)60年代初應(yīng)用減毒活疫苗后發(fā)病率顯著下降，但每年仍有散發(fā)患者在一定范圍內(nèi)流行，甚至引起死亡。因此，提高和改進(jìn)麻疼快速診斷技術(shù)及時(shí)掌握麻疼疫情對(duì)該病的防控尤為重要。 核蛋白（Nudeocapsid N)是麻疼病毒顆粒中含量最多的蛋白，是病毒在繁殖和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中第一個(gè)被合成的蛋白，具有較強(qiáng)的抗原活性，，是麻疼病毒的主要抗原之一。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)NCBI上公布的麻疼病毒N蛋白基因序列，利用premer5.0設(shè)計(jì)引物。從含有麻疼抗原全基因序列的質(zhì)粒中，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段，與載體pET-32a(+)分別進(jìn)行BamH I與;I雙酶切，T4DNA連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE)3,培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單菌落，在培養(yǎng)物中加入IPTG誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳檢測(cè)，并對(duì)表達(dá)菌基因組測(cè)序，最終成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pET-32a (+)/N。之后對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定N蛋白最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件為：培養(yǎng)溫度37°C, IPTG濃度0.20mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間4h。目的蛋白含（H S)標(biāo)簽，便于鎳離子親和層析純化，結(jié)果顯示蛋白純度可達(dá)90%。 將表達(dá)的N蛋白應(yīng)用于免疫層析膠體金檢測(cè)試紙條的研制，采用梓檬酸三} 還原法，制備出三種不同粒徑的膠體金溶液，通過(guò)實(shí)驗(yàn)蹄選出顆粒直徑均一（24nm性質(zhì)穩(wěn)定的膠體金，用它標(biāo)記麻疼病毒N抗原（標(biāo)記量26i^g/mL)制備免疫膠體金，用純化后的N蛋白（1.25mg/mL)和N蛋白多抗（1.0mg/mL)包被于5肖酸纖維素膜（NC)分別作為檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）和質(zhì)控線(xiàn)（C線(xiàn)），組裝試紙條，進(jìn)行特異性、靈敏性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該試紙條具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，初步達(dá)到了檢測(cè)麻疼病毒N抗體的要求。
【關(guān)鍵詞】：麻疼病毒 N蛋白 表達(dá)純化 膠體金
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R373.11
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 符號(hào)與縮略語(yǔ)10-11
• 第一章 結(jié)論11-21
• 1.1 麻疹概述11-18
• 1.1.1 麻疹病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)11-12
• 1.1.2 麻疹病毒的生物學(xué)特性12
• 1.1.3 麻疹病毒的基因結(jié)構(gòu)及核蛋白(N)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)12-13
• 1.1.4 麻疹病毒的變異性及其危害13-14
• 1.1.5 麻疹病毒的檢測(cè)方法及其研究進(jìn)展14-18
• 1.2 免疫膠體金快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展18-19
• 1.3 本研究的目的和意義19-21
• 第二章 麻疹病毒N蛋白基因的克隆及其表達(dá)與純化21-43
• 2.1 材料和試劑21-31
• 2.1.1 菌種和載體21-22
• 2.1.2 引物22
• 2.1.3 主要儀器與設(shè)備22-23
• 2.1.4 主要試劑23-24
• 2.1.5 主要試劑的配制24-31
• 2.2 方法31-39
• 2.2.1 N蛋白基因的克隆31-33
• 2.2.2 目的基因與表達(dá)載體連接33-34
• 2.2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)34-36
• 2.2.4 測(cè)序鑒定和菌種保藏36
• 2.2.5 小樣誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化36-37
• 2.2.6 重組pET-32a(+)/N蛋白純化及Westblot鑒定37-39
• 2.3 結(jié)果39-42
• 2.3.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建39
• 2.3.2 重組菌pET-32a(+)/N的誘導(dǎo)表達(dá)39-40
• 2.3.3 表達(dá)菌種的測(cè)序40
• 2.3.4 重組pET-32a(+)/N誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果40-41
• 2.3.5 重組pET-32(+)/N蛋白的純化及蛋白印跡鑒定41-42
• 2.4 討論42-43
• 第三章 麻疹膠體金免疫層析試紙條的研制43-55
• 3.1 材料43-44
• 3.1.1 試劑及材料43
• 3.1.2 主要試劑及配制43-44
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備44
• 3.2 方法44-48
• 3.2.1 膠體金的制備及其鑒定44-45
• 3.2.2 金標(biāo)抗體的制備及質(zhì)量鑒定45-46
• 3.2.3 試紙條的組裝及檢測(cè)結(jié)果判定46-47
• 3.2.4 試紙條特異性實(shí)驗(yàn)47
• 3.2.5 試紙條靈敏性實(shí)驗(yàn)47
• 3.2.6 試紙條穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)47
• 3.2.7 試紙條重復(fù)性試驗(yàn)47-48
• 3.3 結(jié)果48-53
• 3.3.1 膠體金質(zhì)量鑒定48-49
• 3.3.2 膠體金顆粒大小的選擇49
• 3.3.3 免疫膠體金優(yōu)化選擇及鑒定49-50
• 3.3.4 檢測(cè)線(xiàn)及質(zhì)控線(xiàn)包被濃度的選擇及結(jié)果鑒定50-51
• 3.3.5 試紙條特異性檢測(cè)結(jié)果51-52
• 3.3.6 試紙條靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-53
• 3.3.7 試紙條穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果53
• 3.3.8 試紙條重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果53
• 3.4 討論53-55
• 第四章 結(jié)論與展望55-57
• 4.1 結(jié)論55
• 4.2 展望55-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 附錄A65-67
• 致謝67-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄68-69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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  本文關(guān)鍵詞：麻疹病毒N蛋白的原核表達(dá)、純化及膠體金免疫層析法的初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：390841