本文關鍵詞：昆明市小兒腹瀉相關病毒的分子流行病學研究及病毒基因組克隆，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小兒腹瀉疾病(pedo-diarrheal disease)是由多病原、多因素引起的以大便次數(shù)增多和大便性狀改變?yōu)樘攸c的消化道疾病,是導致全球5歲以下兒童死亡的第二大原因。其病因復雜,治療較困難,易造成營養(yǎng)不良等疾病,嚴重影響嬰幼兒的生長發(fā)育,甚至引起死亡,是發(fā)展中國家小兒死亡的主要原因之一,故WHO把腹瀉病的控制列為全球性戰(zhàn)略。病毒性腹瀉是是小兒腹瀉的主要類型,引起小兒腹瀉的主要病原體有：人輪狀病毒(human rotavirus, HRV)、人諾如病毒(human norovirus, HNV)人星狀病毒(human astro virus, HAstV)、腸道病毒(entero virus, ET virus)、甲肝病毒(hepatovirus)等,其中最常見的是HRV. HNV和HAstV。本研究主要針對昆明市小兒腹瀉有關病毒HRV、 HNV和HAstV進行分子流行病學研究；利用逆轉錄PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)擴增得到部分HNV全基因組cDNA和全部HAstV全基因組序列；另外,以人結腸癌細胞(HT-29cell)為基質,對HT-29細胞分離培養(yǎng)HAstV的相關條件進行了初步探索。 (1)昆明地區(qū)HRV、 HNV和HAstV流行病學研究和病毒分型 根據(jù)基因庫中HRV、 HNV和HAstV各病毒的核苷酸特異性高度保守區(qū)設計病毒鑒定引物和病毒分型引物。通過對RT-PCR檢測體系及條件的摸索,建立起穩(wěn)定的HRV、 HNV和HAstV三種病毒檢測體系。對39份小兒腹瀉糞便檢測結果為：HRV13份、HNV12份和HAstV12份,占總量百分比分別為的33.33%、30.77%、30.77%。 通過RT-PCR和分型序列測序方法對病毒分型,HNV全為GⅡ型；HAstV全為HAstV-1型；HRV型別有：2例?P[6]、1例?P[9]、1例?P[10]、1例?P[8]、1例G2P[8]、4例G2P[4]、1例?P[4]和?P[8]混合感染樣品、1例G2P[8]和G8P[8]混合感染樣品,其中G2P[4]型所占比列最高33.3%,可能為昆明地區(qū)HRV的優(yōu)勢流行株。 (2)克隆HNV和HAstV病毒基因組cDNA 從NCBI GeneBank中下載各型別HNV和HAstV病毒全基因組,用DNAMAN軟件比對后,根據(jù)比對結果設計病毒基因組擴增引物各6對。RT-PCR對HNV和HAstV基因組擴增結果為：3段HNV全基因組共計3.6kb；全長HAstV基因組6.8kb,上傳至GENEBANK登錄號為KC342249,并命名為KM-l。 HAstV全基因組核苷酸序列與同型別病毒株SH-1同源性為98.4%,印度株(G1)95.0%；與其它型別病毒同源性分別為：G282.9%,G381.9%,G476.2%,G582%,G666.2%, G884.5%。 KM-1全基因組氨基酸同源性比較,發(fā)現(xiàn)KM-1的ORFla, ORFlb編碼的非結構蛋白前體和RNA依賴的RNA酶與其它型別的病毒株同源性較高,而KM-1ORF2編碼的衣殼蛋白前體氨基酸與同型別病毒同源性較高,印度株為97.97%,上海株(SH-1)為98.35%；與不同型別的HAstV在該區(qū)段的同源性較低,在62.64%-75.79%之間。重組事件分析發(fā)現(xiàn)KM-1有3個序列區(qū)域發(fā)生重組,分別是1996-2229堿基區(qū)、3608-4155堿基區(qū)和3608-4155區(qū)域。1996-2229區(qū)域與俄羅斯株(GU732187)同源性最高：3608-4155區(qū)域與韓國株(JN887820)同源性較高,5937-5981區(qū)域可能來源于印度株(AF260508)。 (3) HAstV的培養(yǎng) 以初培養(yǎng)密度為40%-50%的HT-29細胞為基質,將病毒稀釋液處理后的HAstV腹瀉糞便上清1ml接種到HT-29細胞上,并加入胰蛋白酶致終濃度10ug/mL,用含2%小牛血清的維持液培養(yǎng),第3、6d后分別收取細胞和上清,RT-PCR鑒定結果表明HAstV能夠被HT-29細胞從糞便樣品中分離出來。PEG或超濾法濃縮病毒后電鏡鏡檢觀察到HAstV,直徑為40nm左右。 本實驗較為詳細的對2012-2013年昆明地區(qū)小兒腹瀉有關病毒分子流行病學調查并準確地進行了病毒分型,以上數(shù)據(jù)連同擴增得到的HNV、 HAstV基因組以及HAstV的成功培養(yǎng),為進一步研究HRV、 HNV、 HAstV打下了堅實的基礎。
【關鍵詞】：小兒腹瀉 病毒 檢測 分子流行病學 基因組 克隆 培養(yǎng)
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目錄9-12
• 插圖和附表清單12-14
• 英文縮略語索引14-15
• 第一章 緒論15-28
• 1.1 小兒腹瀉15-16
• 1.1.1 小兒腹瀉臨床癥狀15
• 1.1.2 小兒腹瀉的起因15-16
• 1.2 輪狀病毒16-18
• 1.2.1 HRV的結構特征16-17
• 1.2.2 HRV的流行情況17
• 1.2.3 HRV的基因分型17-18
• 1.3 諾如病毒18-20
• 1.3.1 HNV結構特征18-19
• 1.3.2 HNV流行病學19-20
• 1.3.3 HNV的基因分型20
• 1.4 星狀病毒20-22
• 1.4.1 HAstV結構特征21
• 1.4.2 HAstV的流行情況21
• 1.4.3 HAstV基因分型21-22
• 1.5 HRV、HNV和HAsTV研究現(xiàn)狀22-26
• 1.5.1 HRV、HNV和HAstV發(fā)病機理22-23
• 1.5.2 HRV、HNV和HAstV診斷檢測技術23-24
• 1.5.3 HRV、HNV和HAstV預防及治療24-26
• 1.6 本論文研究目的及意義26-28
• 第二章 小兒腹瀉有關病毒分子流行病學分析28-56
• 2.1 材料和方法28-40
• 2.1.1 材料28-35
• 2.1.2 方法35-40
• 2.2 結果40-52
• 2.2.1 RT-PCR法檢測小兒腹瀉有關病毒40-48
• 2.2.2 HNV、HAstV基因型分析48-49
• 2.2.3 昆明市小兒腹瀉有關病毒流行病學統(tǒng)計49-52
• 2.3 討論52-55
• 2.3.1 RT-PCR檢測體系的評價52-53
• 2.3.2 昆明市小兒腹瀉有關病毒流行病學統(tǒng)計53-54
• 2.3.3 昆明市小兒腹瀉有關病毒基因型54-55
• 2.4 小結55-56
• 第三章 病毒基因組的克隆56-79
• 3.1 材料和方法56-62
• 3.1.1 材料56-58
• 3.1.2 方法58-62
• 3.2 結果62-75
• 3.2.1 HNV、HAstV基因組的克隆62-63
• 3.2.2 HNV、HAstV基因組測序63-75
• 3.3 討論75-78
• 3.3.1 病毒基因組引物設計75
• 3.3.2 RT-PCR擴增病毒基因組全序列對糞便樣品量的要求75
• 3.3.3 HAstV全基因組序列測定與系統(tǒng)進化樹分析75-76
• 3.3.4 HAstV全基因組核苷酸同源性比較及各個區(qū)編碼的氨基酸序列同源性比較76-77
• 3.3.5 HAstV全基因組序列重組事件分析77-78
• 3.4 小結78-79
• 第四章 星狀病毒的培養(yǎng)79-91
• 4.1 材料和方法79-84
• 4.1.1 材料79-82
• 4.1.2 方法82-84
• 4.2 結果84-87
• 4.2.1 HT-29細胞的培養(yǎng)84
• 4.2.2 HT-29細胞種毒星狀病毒84-85
• 4.2.3 RT-PCR檢測種毒結果85-86
• 4.2.4 電鏡觀察結果86-87
• 4.3 討論87-90
• 4.3.1 星狀病毒的細胞培養(yǎng)87-89
• 4.3.2 Caco-2細胞與HT-29細胞的比較89
• 4.3.3 HT-29細胞培養(yǎng)HAstV89
• 4.3.4 影響種毒的關鍵因素89-90
• 4.4 小結90-91
• 第五章 全文總結91-92
• 第六章 展望92-93
• 致謝93-94
• 參考文獻94-100
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文及參與項目目錄100

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：昆明市小兒腹瀉相關病毒的分子流行病學研究及病毒基因組克隆，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：390619