本文關鍵詞：SM22α泛素化對PDGF-BB誘導的VSMC增殖的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式,受到細胞外信號的嚴格調控。我室研究證明，PDGF-BB可以誘導血管平滑肌細胞(VSMC)標志物——SM22α發(fā)生磷酸化和泛素化,并且該過程與SM22α蛋白表達水平下調具有時相相關性。因此，我們推測SM22α發(fā)生泛素化可能對VSMC的增殖產生影響。本研究通過轉染SM22α及其泛素化突變體，觀察SM22α泛素化修飾對PDGF-BB誘導的VSMC增殖的影響，探討SM22α泛素化修飾的意義及其分子機制。 方法與結果： 1PDGF-BB對VSMC細胞增殖活性的影響 MTT和細胞計數(shù)分析結果顯示，PDGF-BB刺激12h時，VSMC增殖活性顯著升高，24h時達到高峰，呈時間依賴性。 2PDGF-BB對SM22α泛素化水平的影響 免疫共沉淀結果顯示，PDGF-BB作用于VSMC12h，SM22α的泛素化水平顯著增高，24h達高峰，48h時仍維持在較高水平。該變化與細胞增殖活性增加趨勢相吻合，且具有時相相關性。 3HA-SM22α與泛素化位點突變體的構建與鑒定 分別構建HA-SM22α和HA-SM22α泛素化位點突變的融合蛋白表達質粒，，重組質粒經PCR擴增、EcoR I/Xho I雙酶切及測序鑒定后，命名為HA-SM22α、HA-SM22α(K17R)、HA-SM22α(K20R)、HA-SM22α(K21R)、HA-SM22α(K89R)和HA-SM22α(K121R)。 4SM22α泛素化突變體對PDGF-BB誘導的VSMC增殖的影響 利用siRNA敲低內源性SM22α的表達，分別將SM22α野生型(WT)及泛素化突變體轉染VSMC，然后用PDGF-BB刺激24h。MTT和細胞計數(shù)分析結果表明，野生型HA-SM22α可以抑制PDGF-BB誘導的VSMC增殖，而HA-SM22α(K21R)則增強PDGF-BB的促增殖活性。 5SM22αK21泛素化突變體對PDGF-BB誘導的PCNA表達的影響 利用siRNA敲低內源性SM22α后，過表達野生型SM22α及K21泛素化突變體SM22α(K21R)，再給予PDGF-BB刺激24h。Western Blot結果顯示，PDGF-BB可誘導PCNA的表達，轉染野生型HA-SM22α顯著抑制PDGF-BB誘導的PCNA表達上調，而轉染HA-SM22α(K21R)則不具有這樣的抑制作用。 6SM22αK21泛素化突變體對PDGF-BB誘導的ERK1/2信號通路的影響 利用siRNA敲低內源性SM22α，然后過表達野生型SM22α及K21泛素化突變體SM22α(K21R)，再給予PDGF-BB刺激30min。Western Blot結果提示，HA-SM22α(K21R)突變體喪失對ERK1/2增殖信號通路的抑制作用。 結論： 1PDGF-BB可以誘導SM22α發(fā)生泛素化。 2HA-SM22α(K21R)失活突變體喪失對ERK1/2信號通路激活和VSMC增殖的抑制作用。
【關鍵詞】：血管平滑肌細胞 細胞增殖 平滑肌22α 泛素化
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 前言9-10
• 材料與方法10-16
• 結果16-19
• 附圖19-27
• 討論27-29
• 結論29
• 參考文獻29-32
• 綜述 蛋白質 SUMO 化修飾的研究進展32-44
• 參考文獻39-44
• 致謝44-45
• 個人簡歷45

  本文關鍵詞：SM22α泛素化對PDGF-BB誘導的VSMC增殖的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：390260