本課題的研究目標(biāo)是對流感病毒血凝素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域（HA2）進(jìn)行截短和突變，篩選獲得長度最短、轉(zhuǎn)位功能較強(qiáng)的HA2優(yōu)化短肽，用于靶向促凋亡分子的構(gòu)建。在本課題組前期的工作中，已將HA2引入到靶向促凋亡分子中，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有轉(zhuǎn)位活性，能夠促進(jìn)殺傷效應(yīng)分子從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)位到胞漿，增強(qiáng)抗腫瘤作用。在此基礎(chǔ)上，本研究對HA2進(jìn)行改構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計獲得了6種截短體和3種突變體，通過體外紅細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)、腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（FRET）比較這些HA2截短體/突變體的轉(zhuǎn)位功能強(qiáng)弱。首先，我們利用體外紅細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)對HA2改構(gòu)體進(jìn)行功能篩選，如果破壞紅 細(xì)胞膜的能力越強(qiáng)，就會導(dǎo)致上清中血紅蛋白含量越高，表明HA2改構(gòu)體的轉(zhuǎn)位功能越強(qiáng)。以野生型HA2作為對照，將合成的上述9種HA2截短體/突變體與分離的人外周血紅細(xì)胞相孵育。劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)和時間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明，在相同條件下E5C3的溶血能力強(qiáng)于HA2，E5弱于HA2，并且呈現(xiàn)出時間依賴關(guān)系和某種程度的劑量依賴關(guān)系。羧基端的3個截短體C3、C15、C8中，僅C3具有溶血能力，提示HA2的2個螺旋區(qū)對于溶血功能至關(guān)重要，去掉一個或兩個均會使HA2...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2-2pCMV-e23sFv-Fdt-HA2-tBid的酶切鑒定圖譜

e23sFvFdttApaⅠNotⅠtBidXhaⅠHindⅢ圖2-1重組載體結(jié)構(gòu)示意圖MarkerHindⅢ+ApaⅠHindⅢ+NotⅠNotⅠ+XbaⅠXbaⅠ+A

圖2-3包含HA2截短體/突變體的重組載體酶切鑒定圖譜（均用HindⅢ+ApaⅠ酶切）100

-3包含HA2截短體/突變體的重組載體酶切鑒定圖譜（均用HindⅢ+ACMV-e23sFv-Fdt-HA2-tBid;CMV-e23sFv-Fdt....

圖2-4包含HA2截短體/突變體的靶向促凋亡分子誘導(dǎo)BT474細(xì)胞凋亡裸細(xì)胞pCMV-e23sFv-Fdt-E5C3M7-tBidpCMV-e23sFv-Fdt-tBiddpCMV

為：E5C310.38%±0.0042>HA28.6%±0.0031>Null5.01%±0.0044>E5C3M74.98%±0.0055>C....

圖2-6包含HA2截短體/突變體的靶向促凋亡分子誘導(dǎo)SKBR3細(xì)胞凋亡裸細(xì)胞pCMV-e23sFv-Fdt-E5C3M7-tBidpCMV-e23sFv-Fdt-tBiddpCMV

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文pCMV-e23sFv-Fdt-HA2-tBidpCMV-e23sFv-Fdt-M7-tBidpCMV-e23sFv-....

本文編號：3897137