MicroRNAs (miRNAs)在紅系分化調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。盡管已經(jīng)報(bào)道了一些調(diào)控紅系分化的miRNA,但是關(guān)于紅系分化特異轉(zhuǎn)錄因子GATA-1如何通過miRNA促進(jìn)紅系分化的機(jī)制,目前尚不清楚。本文對(duì)GATA-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的三個(gè)小RNA, miR-23a、 miR-27a和miR-24-2(miR-23a/27a/24)在紅系分化過程中的功能和分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究。 第一部分工作,我們通過miRNA表達(dá)芯片對(duì)GATA-1潛在調(diào)控并在紅系分化過程中表達(dá)逐漸上調(diào)的miRNA進(jìn)行了系統(tǒng)性分析,從中篩選出miR-23a作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。在CD34+造血干細(xì)胞和紅白血病K562細(xì)胞中,我們驗(yàn)證了GATA-1對(duì)miR-23a的正調(diào)控作用以及miR-23a在紅系分化中的表達(dá)變化。我們也通過miRNA過表達(dá)及敲低實(shí)驗(yàn),在CD34+造血干細(xì)胞、斑馬魚及小鼠中證明了miR-23a促進(jìn)紅系分化的功能。在分子機(jī)制的研究中,我們發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)紅系分化的功能是通過靶向抑制酪氨酸磷酸酶SHP2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。第二部分工作,我們對(duì)miR-23a基因簇的另外兩個(gè)成員miR-27a和miR-24(miR-24-2...

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
前言
材料與方法
    一、實(shí)驗(yàn)材料
        1. 工具酶及分子量Marker
        2. 主要生化試劑
        3. 培養(yǎng)基、血清及添加劑
        4. 細(xì)胞因子
        5. 試劑盒
        6. 同位素標(biāo)記化合物
        7. 菌株
        8. 質(zhì)粒
        9. 細(xì)胞系
        10. 人臍帶血標(biāo)本
        11. 引物、探針及morpholino
        12. 生物信息學(xué)分析軟件
        13. 主要儀器及設(shè)備
    二、實(shí)驗(yàn)方法
        1. 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)
            1.1 細(xì)胞系的誘導(dǎo)
            1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            1.3 聯(lián)苯胺染色
            1.4 造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)
        2. 分子學(xué)實(shí)驗(yàn)
            2.1. Real-time PCR
            2.2. MiRNA real-time PCR
            2.3. MiRNA的PAGE及Northern雜交
            2.4. 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)
            2.5. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.6. 質(zhì)粒DNA的提取
            2.7. 慢病毒的包裝
            2.8. Western blot
            2.9. 雙螢光報(bào)告實(shí)驗(yàn)
        3. 斑馬魚實(shí)驗(yàn)
            3.1. 原位雜交(In situ hybridization)
            3.2. 雙重原位雜交(Double in situ hybridization)
            3.3. O-Dianisidine染色
        4. 小鼠實(shí)驗(yàn)
        5. MiRNA microarray
結(jié)果
    第一部分 MIR-23a在紅系分化過程中的功能及分子機(jī)制
        1. 表達(dá)譜分析篩選受GATA-1正向調(diào)控的miRNAs
            1.1. MiRNA基因芯片表達(dá)分析結(jié)果
            1.2. 篩選在紅系分化過程中受GATA-1正向調(diào)控的miRNAs
        2. MiR-23a在紅系分化過程中的功能
            2.1. MiR-23a在紅系分化過程中的表達(dá)
            2.2. 驗(yàn)證GATA-1對(duì)miR-23a的正向調(diào)控
            2.3. MiR-23a在K562細(xì)胞紅系分化中的功能
            2.4. CD34+造血干細(xì)胞向紅系分化過程中miR-23a的功能
        3. MiR-23a促進(jìn)紅系分化的分子機(jī)制
            3.1. MiR-23a成熟序列的同源性分析
            3.2. 驗(yàn)證SHP2是miR-23a的靶基因
            3.3. 檢測(cè)SHP2在紅系分化過程中的表達(dá)
            3.4. CD34+造血干細(xì)胞中驗(yàn)證miR-23a靶向抑制SHP2的表達(dá)
            3.5. Rescue實(shí)驗(yàn)證明miR-23a通過抑制SHP2表達(dá)促進(jìn)紅系分化
        4. SHP2抑制紅系分化
            4.1. SHP2在K562細(xì)胞中的功能
            4.2. CD34+造血干細(xì)胞中驗(yàn)證SHP2的功能
        5. 驗(yàn)證由miR-23a介導(dǎo)的GATA-1負(fù)調(diào)控SHP2的調(diào)節(jié)回路
            5.1. GATA-1抑制SHP2蛋白水平的表達(dá)
            5.2. 在CD34+造血干細(xì)胞中miR-23a-GATA1-SHP2調(diào)節(jié)loop進(jìn)行驗(yàn)證
        6. MiR-23a在斑馬魚中的功能驗(yàn)證
            6.1. MiR-23a成熟序列在物種中的保守性分析
            6.2. MiR-23a在斑馬魚中的表達(dá)
            6.3. MiR-23a在斑馬魚中的功能
            6.4. 0- Dianisidine染色檢測(cè)敲低miR-23a后斑馬魚血紅蛋白的表達(dá)
            6.5. 檢測(cè)敲低miR-23a抑制斑馬魚初級(jí)造血
            6.6. 敲低miR-23a抑制斑馬魚紅細(xì)胞生成
        7. MiR-23a促進(jìn)小鼠紅細(xì)胞生成
            7.1. 在小鼠中過表達(dá)miR-23a
            7.2. 過表達(dá)miR-23a對(duì)小鼠造血干細(xì)胞向紅系分化的影響
            7.3. HE染色檢測(cè)過表達(dá)miR-23a對(duì)脾臟紅細(xì)胞生成的影響
    第二部分 MIR-27a/24在紅系分化過程中的功能及分子機(jī)制
        1. MiR-27a/24在紅系分化過程中的表達(dá)
            1.1. K562細(xì)胞中miR-27a/24在紅系分化過程中的表達(dá)
            1.2. CD34+造血干細(xì)胞中miR-27a/24在紅系分化過程中的表達(dá)
        2. GATA-1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)miR-27a/24的表達(dá)
            2.1. GATA-1在miR-23a/27a/24基因上游promoter區(qū)的結(jié)合
            2.2. GATA-1正向調(diào)節(jié)miR-27a/24的表達(dá)
            2.3. GATA-1在w//?-27lf/24基因上游promoterlx.的結(jié)合隨分化的進(jìn)行逐漸增強(qiáng)
            2.4. 雙熒光驗(yàn)證GATA-1對(duì)miR-27a/24的正向調(diào)節(jié)
        3. MiR-27a和miR-24在紅系分化中的功能
            3.1. K562細(xì)胞中miR-27a/24對(duì)紅系分化的影響
            3.2. MiR-27a和miR-24對(duì)斑馬魚紅系分化的影響
            3.3. Mir-27a/24對(duì)小鼠紅細(xì)胞生成的影響
        4. MiR-27a/24促進(jìn)紅系分化的分子機(jī)制
            4.1. MiR-27a/24靶向抑制GATA-2的表達(dá)
            4.2. GATA-1/2 switch調(diào)控miR-27a/24的表達(dá)
            4.3. MiR-27a/24調(diào)節(jié)GATA-1/2 switch開關(guān)形成正反饋調(diào)控回路
討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
英文名詞及縮寫
攻讀博士期間發(fā)表的文章
致謝



本文編號(hào)：3894420