MicroRNAs (miRNAs)在紅系分化調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。盡管已經(jīng)報道了一些調(diào)控紅系分化的miRNA,但是關(guān)于紅系分化特異轉(zhuǎn)錄因子GATA-1如何通過miRNA促進紅系分化的機制,目前尚不清楚。本文對GATA-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的三個小RNA, miR-23a、 miR-27a和miR-24-2(miR-23a/27a/24)在紅系分化過程中的功能和分子機制進行了深入研究。 第一部分工作,我們通過miRNA表達芯片對GATA-1潛在調(diào)控并在紅系分化過程中表達逐漸上調(diào)的miRNA進行了系統(tǒng)性分析,從中篩選出miR-23a作為進一步的研究對象。在CD34+造血干細胞和紅白血病K562細胞中,我們驗證了GATA-1對miR-23a的正調(diào)控作用以及miR-23a在紅系分化中的表達變化。我們也通過miRNA過表達及敲低實驗,在CD34+造血干細胞、斑馬魚及小鼠中證明了miR-23a促進紅系分化的功能。在分子機制的研究中,我們發(fā)現(xiàn)其促進紅系分化的功能是通過靶向抑制酪氨酸磷酸酶SHP2的表達來實現(xiàn)。第二部分工作,我們對miR-23a基因簇的另外兩個成員miR-27a和miR-24(miR-24-2...

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【學(xué)位級別】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
前言
材料與方法
    一、實驗材料
        1. 工具酶及分子量Marker
        2. 主要生化試劑
        3. 培養(yǎng)基、血清及添加劑
        4. 細胞因子
        5. 試劑盒
        6. 同位素標(biāo)記化合物
        7. 菌株
        8. 質(zhì)粒
        9. 細胞系
        10. 人臍帶血標(biāo)本
        11. 引物、探針及morpholino
        12. 生物信息學(xué)分析軟件
        13. 主要儀器及設(shè)備
    二、實驗方法
        1. 細胞學(xué)實驗
            1.1 細胞系的誘導(dǎo)
            1.2 細胞轉(zhuǎn)染
            1.3 聯(lián)苯胺染色
            1.4 造血干細胞的體外培養(yǎng)
        2. 分子學(xué)實驗
            2.1. Real-time PCR
            2.2. MiRNA real-time PCR
            2.3. MiRNA的PAGE及Northern雜交
            2.4. 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)
            2.5. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.6. 質(zhì)粒DNA的提取
            2.7. 慢病毒的包裝
            2.8. Western blot
            2.9. 雙螢光報告實驗
        3. 斑馬魚實驗
            3.1. 原位雜交(In situ hybridization)
            3.2. 雙重原位雜交(Double in situ hybridization)
            3.3. O-Dianisidine染色
        4. 小鼠實驗
        5. MiRNA microarray
結(jié)果
    第一部分 MIR-23a在紅系分化過程中的功能及分子機制
        1. 表達譜分析篩選受GATA-1正向調(diào)控的miRNAs
            1.1. MiRNA基因芯片表達分析結(jié)果
            1.2. 篩選在紅系分化過程中受GATA-1正向調(diào)控的miRNAs
        2. MiR-23a在紅系分化過程中的功能
            2.1. MiR-23a在紅系分化過程中的表達
            2.2. 驗證GATA-1對miR-23a的正向調(diào)控
            2.3. MiR-23a在K562細胞紅系分化中的功能
            2.4. CD34+造血干細胞向紅系分化過程中miR-23a的功能
        3. MiR-23a促進紅系分化的分子機制
            3.1. MiR-23a成熟序列的同源性分析
            3.2. 驗證SHP2是miR-23a的靶基因
            3.3. 檢測SHP2在紅系分化過程中的表達
            3.4. CD34+造血干細胞中驗證miR-23a靶向抑制SHP2的表達
            3.5. Rescue實驗證明miR-23a通過抑制SHP2表達促進紅系分化
        4. SHP2抑制紅系分化
            4.1. SHP2在K562細胞中的功能
            4.2. CD34+造血干細胞中驗證SHP2的功能
        5. 驗證由miR-23a介導(dǎo)的GATA-1負調(diào)控SHP2的調(diào)節(jié)回路
            5.1. GATA-1抑制SHP2蛋白水平的表達
            5.2. 在CD34+造血干細胞中miR-23a-GATA1-SHP2調(diào)節(jié)loop進行驗證
        6. MiR-23a在斑馬魚中的功能驗證
            6.1. MiR-23a成熟序列在物種中的保守性分析
            6.2. MiR-23a在斑馬魚中的表達
            6.3. MiR-23a在斑馬魚中的功能
            6.4. 0- Dianisidine染色檢測敲低miR-23a后斑馬魚血紅蛋白的表達
            6.5. 檢測敲低miR-23a抑制斑馬魚初級造血
            6.6. 敲低miR-23a抑制斑馬魚紅細胞生成
        7. MiR-23a促進小鼠紅細胞生成
            7.1. 在小鼠中過表達miR-23a
            7.2. 過表達miR-23a對小鼠造血干細胞向紅系分化的影響
            7.3. HE染色檢測過表達miR-23a對脾臟紅細胞生成的影響
    第二部分 MIR-27a/24在紅系分化過程中的功能及分子機制
        1. MiR-27a/24在紅系分化過程中的表達
            1.1. K562細胞中miR-27a/24在紅系分化過程中的表達
            1.2. CD34+造血干細胞中miR-27a/24在紅系分化過程中的表達
        2. GATA-1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)miR-27a/24的表達
            2.1. GATA-1在miR-23a/27a/24基因上游promoter區(qū)的結(jié)合
            2.2. GATA-1正向調(diào)節(jié)miR-27a/24的表達
            2.3. GATA-1在w//?-27lf/24基因上游promoterlx.的結(jié)合隨分化的進行逐漸增強
            2.4. 雙熒光驗證GATA-1對miR-27a/24的正向調(diào)節(jié)
        3. MiR-27a和miR-24在紅系分化中的功能
            3.1. K562細胞中miR-27a/24對紅系分化的影響
            3.2. MiR-27a和miR-24對斑馬魚紅系分化的影響
            3.3. Mir-27a/24對小鼠紅細胞生成的影響
        4. MiR-27a/24促進紅系分化的分子機制
            4.1. MiR-27a/24靶向抑制GATA-2的表達
            4.2. GATA-1/2 switch調(diào)控miR-27a/24的表達
            4.3. MiR-27a/24調(diào)節(jié)GATA-1/2 switch開關(guān)形成正反饋調(diào)控回路
討論
小結(jié)
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
英文名詞及縮寫
攻讀博士期間發(fā)表的文章
致謝



本文編號：3894420