本文關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增的方法,觀察MSCs體外培養(yǎng)增殖的生物學(xué)特性,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)細(xì)胞表型,分析鑒定MSCs的純度。 方法： 本論文采用的主要研究方法如下： (1)無(wú)菌條件下抽取骨髓液5mL,用等體積PBS稀釋混勻,室溫下1500rpm離心10分鐘,棄去脂肪層,將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液(1.077g/mL)上面,室溫2500rpm離心30分鐘,吸取界面白膜狀層的單個(gè)核細(xì)胞。用PBS混懸后,室溫1500rpm離心10分鐘,棄上清并重復(fù)洗滌2次。用含10%FBS的LG—DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2x105/mL,接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3天后首次換液,棄去懸浮細(xì)胞后,每2-3天換液一次。每日鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)變化,待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%-90%融合時(shí),用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA (1:1, V/V)進(jìn)行消化,再按1：2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng),共傳代三次。 (2) MSCs的生長(zhǎng)曲線測(cè)定：取P3細(xì)胞,按5×104/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每天取3孔,計(jì)算平均值,連續(xù)培養(yǎng)8天,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法,繪制生長(zhǎng)曲線。 (3)貼壁率測(cè)定：取P3細(xì)胞,按5×104/mL濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng),每2小時(shí)取2瓶,消化計(jì)數(shù),計(jì)算貼壁率,繪制貼壁率曲線。 (4) MSCs的表型鑒定：取P3細(xì)胞,將細(xì)胞消化吹打制成單細(xì)胞懸液,1500rpm離心5分鐘,棄去上清液,用PBS重復(fù)洗滌后,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL,各取細(xì)胞懸液100μL,分別滴加熒光標(biāo)記抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、 HLA-DR-PE抗體10μL,4℃避光孵育30分鐘,PBS洗滌后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),確定MSCs的表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。 結(jié)果： (1) MSCs屬于骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞,采用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結(jié)合可以有效分離、純化人骨髓MSCs。細(xì)胞形態(tài)觀察：細(xì)胞初接種入培養(yǎng)瓶時(shí)為圓形的單個(gè)核細(xì)胞,大小不一,與周?chē)难?xì)胞相互混雜。培養(yǎng)24小時(shí)后,細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)貼壁,48-72小時(shí)細(xì)胞貼壁逐漸增多,72小時(shí)首次換液后,可見(jiàn)少量分散的短梭形及不規(guī)則多角形的初始貼壁細(xì)胞。第4-8天細(xì)胞生長(zhǎng)快,呈集落樣生長(zhǎng),可見(jiàn)有粗大的突起伸出,細(xì)胞形態(tài)呈梭形。第10-12天后細(xì)胞克隆進(jìn)一步擴(kuò)大,呈大的長(zhǎng)梭形,培養(yǎng)至第14-16天時(shí)貼壁細(xì)胞可達(dá)80%～90%融合,大量貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀成纖維細(xì)胞樣形態(tài)并列或呈漩渦狀排列。傳代細(xì)胞剛接種時(shí)為圓形,較大,24小時(shí)內(nèi)能完全貼壁,伸展呈梭形,增殖迅速,5-7天細(xì)胞融合可達(dá)90%。細(xì)胞形態(tài)均勻,與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似,大部分呈長(zhǎng)梭狀,排列規(guī)則。 (2) MSCs的生長(zhǎng)曲線分析：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形,原代細(xì)胞生長(zhǎng)比傳代細(xì)胞慢。原代細(xì)胞接種后第0-3天為生長(zhǎng)潛伏期；第4-12天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；此后逐漸減緩,進(jìn)入平臺(tái)期。傳代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)第1-2天細(xì)胞生長(zhǎng)處于潛伏期,第3天開(kāi)始細(xì)胞生長(zhǎng)較快,至第6-7天達(dá)頂點(diǎn),后進(jìn)入平臺(tái)期。 (3)測(cè)定貼壁率：傳代后的細(xì)胞貼壁較快,4小時(shí)貼壁細(xì)胞超過(guò)50%,而12小時(shí)左右超過(guò)90%的細(xì)胞已經(jīng)貼壁。 (4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3細(xì)胞顯示：CD29、CD44、CD105的陽(yáng)性表達(dá)率分別為99.82%、99.82%、97.38%,對(duì)CD34、HLA-DR的陽(yáng)性表達(dá)率分別為4.94%、1.87%。 結(jié)論： (1)聯(lián)合采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法,能獲得較高純度和活性的MSCs,是一種簡(jiǎn)便可行的方法； (2)通過(guò)觀察MSCs的細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特征以及細(xì)胞表型的表達(dá)情況,可對(duì)MSCs進(jìn)行初步鑒定。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 分離 培養(yǎng) 鑒定
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-11
• 第一章 前言11-12
• 第二章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及其移植治療心肌梗死的研究進(jìn)展12-21
• 2.1 概述12-13
• 2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)展歷史13
• 2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性13-16
• 2.3.1 MSCs的來(lái)源與分布13-14
• 2.3.2 MSCs的體外分離、純化14
• 2.3.3 MSCs的體外培養(yǎng)14-15
• 2.3.4 MSCs的細(xì)胞學(xué)特性15-16
• 2.3.5 MSCs的多向分化潛能16
• 2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的研究進(jìn)展16-20
• 2.4.1 基礎(chǔ)研究16-17
• 2.4.2 臨床研究17-18
• 2.4.3 MSCs移植治療心肌梗死的機(jī)制18
• 2.4.4 MSCs移植治療心肌梗死的移植時(shí)機(jī)與途徑18-20
• 2.4.5 安全性評(píng)價(jià)20
• 2.5 結(jié)語(yǔ)20-21
• 第三章 實(shí)驗(yàn)部分21-38
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 3.1.1 骨髓標(biāo)本來(lái)源21
• 3.1.2 主要試劑21
• 3.1.3 儀器設(shè)備21-22
• 3.1.4 主要試劑配制22
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法22-25
• 3.2.1 MSCs的體外分離與培養(yǎng)22-23
• 3.2.1.1 骨髓采集22
• 3.2.1.2 分離與原代培養(yǎng)22-23
• 3.2.1.3 傳代培養(yǎng)23
• 3.2.2 MSCs的凍存與復(fù)蘇23-24
• 3.2.2.1 細(xì)胞凍存23-24
• 3.2.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇24
• 3.2.3 MSCs的鑒定24-25
• 3.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察24
• 3.2.3.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定24-25
• 3.2.3.3 貼壁率的測(cè)定25
• 3.2.3.4 細(xì)胞表型鑒定25
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-32
• 3.3.1 骨髓MSCs的體外分離與培養(yǎng)25-26
• 3.3.1.1 分離及原代培養(yǎng)25-26
• 3.3.1.2 傳代培養(yǎng)26
• 3.3.1.3 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇26
• 3.3.2 骨髓MSCs的鑒定26-32
• 3.3.2.1 形態(tài)學(xué)特征26-30
• 3.3.2.2 生長(zhǎng)曲線分析30
• 3.3.2.3 貼壁率分析30-31
• 3.3.2.4 細(xì)胞表型鑒定31-32
• 3.4 討論32-37
• 3.4.1 MSCs的體外分離與培養(yǎng)33-35
• 3.4.2 MSCs的表型與鑒定35-37
• 3.4.2.1 MSCs的表型35
• 3.4.2.2 MSCs的鑒定35-37
• 3.5 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-46
• 致謝46-47
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄47-48

【參考文獻(xiàn)】

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1 顧翔;許厚田;李銘輝;段俊斐;顧健;陳勇;高松;張玲芳;徐日新;孫磊;劉曉東;謝勇;;外周血干細(xì)胞移植治療老年心肌梗死后心力衰竭患者的療效及安全性[J];中華老年多器官疾病雜志;2009年05期

  本文關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：389238