本文關鍵詞：N-糖基化修飾對人源化IgG抗體藥物生產細胞株篩選的重要性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單克隆抗體生產細胞株的選擇和優(yōu)化對于抗體的生產的成本控制、時間安排至關重要。生產細胞株的篩選可以從兩個方面來評估,一個方面是抗體表達量,另一個方面是抗體質量�？贵w的表達量可通過Protein A定量檢測,較方便快捷。而抗體的質量則表現在多個方面,如抗體的活性、體內半衰期、人體免疫原性等。這些方面的評估手段周期長,且需要大量的樣品做鑒定。研究顯示抗體IgG的Fc區(qū)域N-糖基化修飾是抗體在體內行駛其功能的決定性因素之一。因此若將N-糖鏈結構檢測作為細胞株篩選評價的一項指標,則可降低抗體藥物研發(fā)后期由于活性不理想而造成的損失。在單克隆抗體生產細胞株的初期篩選過程中,細胞的IgG表達量、活力、細胞密度、是否耗酸為細胞株評價的重要參數。本文中,一共涉及兩種抗體的12個表達細胞株。這兩種抗體均以CHO-K1細胞為宿主,使用谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)缺陷型基因擴增系統(tǒng)。細胞株的篩選從細胞轉染開始,我們首先通過ELISA的方法篩選出一批穩(wěn)定表達的細胞株,對這些細胞株再進行懸浮培養(yǎng)馴化,最終根據表達量、活力、細胞密度這三個方面篩選出了兩種抗體表達各6個細胞株,分別是AB001-1-6以及AB002-1～6。對人源化抗體IgG藥物生產細胞株篩選的參數進行了分析和評價,并且發(fā)現N-糖基化修飾的評價是細胞篩選后期必不可少的一個指標。12個細胞株篩選出后,對其進行葡萄糖補糖批培養(yǎng),使其糖含量保持在3g/L以上。從細胞密度、活力、產酸代謝、細胞葡萄糖消耗以及表達量這5個方面分析細胞株的優(yōu)良。結果表明,這12個細胞株在搖瓶內的表現為培養(yǎng)7天內細胞的活力均在90%以上,且細胞均為耗酸型細胞,這兩個特點均利于細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。7天培養(yǎng)結束時,收集上清液,使用Protein A、陽離子柱、陰離子柱三個步驟純化IgG。HPLC-SEC方法檢測發(fā)現,這12個樣品純度均超過99%,保證了它們的N-糖基化修飾檢測不受雜質干擾。IgG抗體’Fc片段的N-糖鏈結構主要為核心巖藻糖修飾的復雜型糖鏈結構,糖鏈末端含有0、1、2個半乳糖修飾(GO,G1,G2),唾液酸修飾極少。使用超高效液相方法N_糖基化分析的結果顯示這12個細胞株中有11個細胞株的糖基化修飾類似,主要為核,心巖藻糖修飾的復雜型糖鏈。糖基化修飾比例最高的為G0F,抗體AB001的GOF修飾比例為44.40+4.18%,而抗體AB002的GOF修飾比例為48.83±7.46%；其次是GIF, AB001抗體的修飾比例為30.60+4.56%,AB002抗體的修飾比例為24.78±8.13%；Man5的修飾比例,AB001為5.10±3.11%,AB002AB002的為4.71±0.85%。這些糖型修飾的比例,與己知相同類型的IgG抗體的N-糖鏈比例類似。AB002的糖基化修飾中有一組數據與其他11個抗體的數據均差異較大,其GOF修飾比例為18.01%,GIF為8.97%,而Man5的修飾比例為25.74%,Man6為13.11%,明顯異常于正常細胞株。寡聚甘露糖的修飾曾被認為會導致IgG在體內的半衰期大大縮短,但近期有報道稱相似比例甘露糖修飾的不同抗體,在體內的半衰期差別很大。CHO細胞糖基化通路中,對甘露糖修飾影響較大的有兩個酶,一個為甘露糖苷酶(mannosidase),另一個為N-乙酰葡萄糖胺轉移酶I(N-acetyl glucosaminyl transferase Ⅰ, GnTI),通過這兩個酶的RNA水平的檢測,也許能發(fā)現該抗體高甘露糖修飾的原因所在。該抗體也可用于檢驗糖基化通路基因改造的效果。因此該高甘露糖修飾比例的抗體具有進一步研究的價值。兩種抗體12個細胞株其N-糖基化修飾的差異說明在相同條件下,使用相同方法篩選出的細胞株,其表達IgG的Fc-N-糖基化修飾可能會存在較大的差異。細胞株篩選出后會對其進行進一步的優(yōu)化,比如培養(yǎng)基、補料、擴大規(guī)模馴化等,這些均需要投入大量的人力和資源。在細胞株發(fā)展的早期,即將抗體N-糖基化修飾的檢測引入作為檢測細胞篩選的一項指標,放避免過多的人力、資源及時間的浪費。造成N-糖鏈修飾差異的因素很多,包括細胞株之間的差異,培養(yǎng)基的成分,培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式等。在篩選到較理想N-糖型修飾IgG表達細胞株的情況下,kG糖型修飾還可以通過基因改造方式進行進一步優(yōu)化。因此N-糖基化修飾的檢測更突顯出了其存在的必要性。
【關鍵詞】：人源IgG 抗體藥物 N-糖基化修飾 細胞株篩選
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 前言8-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 縮略詞14-15
• 第一章 文獻綜述15-24
• 1.1 單克隆抗體藥物概述15-16
• 1.2 單克隆抗體結構及生物學功能16-17
• 1.3 抗體藥物生物功能17-18
• 1.4 單克隆抗體糖基化修飾結構及功能18-22
• 1.5 影響糖鏈修飾的因素以及改善糖鏈修飾的方法22-24
• 第二章 高表達細胞株的篩選及生長特征分析24-31
• 2.1 引言24-25
• 2.2 實驗材料25-26
• 2.2.1 細胞株25
• 2.2.2 主要試劑和溶液25-26
• 2.3 實驗方法26-27
• 2.3.1 細胞株構建方法(該部分內容具體數據未予顯示)26
• 2.3.2 細胞補糖批培養(yǎng)及上清液收集26-27
• 2.4. 實驗結果27-30
• 2.4.1 抗體AB001及AB002表達細胞株的初步篩選及篩選出細胞株的生長代謝特征27-30
• 2.5 討論30-31
• 第三章 細胞表達產物的N-糖基化修飾分析31-39
• 3.1 實驗材料31-32
• 3.2 實驗方法32-33
• 3.2.1 細胞表達IgG純化32
• 3.2.2 HPLC-SEC分析純化所得IgG純度32
• 3.2.3 N-linked糖基化分析32-33
• 3.3 實驗結果33-37
• 3.3.1 HPLC-SEC鑒定各個細胞株純化所得樣品的純度析33
• 3.3.2 細胞株與細胞株之間的N-糖基化修飾會存在較大差異33-37
• 3.4. 討論37-39
• 全文總結39-40
• 致謝40-41
• 附錄：已發(fā)表文章41-42
• 參考文獻42-44

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1 胡卓偉;;“抗體藥物研究”專欄——致辭[J];藥學學報;2012年10期

2 董惠鈞;郭尚敬;姜俊云;;抗體藥物專業(yè)應用型人才培養(yǎng)的探索[J];藥學教育;2013年06期

3 Trisha Gura ,范宗理;抗體藥物的發(fā)展[J];世界科學;2003年01期

4 ;醫(yī)藥w鸞J];上海醫(yī)藥;2010年08期

5 顧江;鄒全明;;治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的抗體藥物[J];中國生物工程雜志;2012年02期

6 李心;龔珉;徐為人;湯立達;;抗體藥物的國內外市場動態(tài)[J];現代藥物與臨床;2012年03期

7 沈倍奮;;抗體藥物研發(fā)概況[J];河南大學學報(醫(yī)學版);2012年04期

8 段須杰;任彤;羅厚勇;劉睿;徐衛(wèi)濤;;用于抗體藥物生產的動物細胞培養(yǎng)基研究進展[J];中國醫(yī)藥生物技術;2014年01期

9 邵榮光;;“抗體藥物研究新趨勢”專欄——致辭[J];中國醫(yī)藥生物技術;2014年04期

10 文翰;;日美研發(fā)出可預防A型流感的抗體[J];國外醫(yī)學情報;2006年04期

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1 沈倍奮;;抗體藥物的設計及改造[A];中國免疫學會第五屆全國代表大會暨學術會議論文摘要[C];2006年

2 陳志南;;抗體藥物[A];中國生物工程學會第四次會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2005年

3 閻水忠;;抗體藥物共軛物的非臨床安全評價[A];中國毒理學會第六屆全國毒理學大會論文摘要[C];2013年

4 貢向輝;李東曉;楊勝利;沈秉謙;;抗體表達過程的平臺技術開發(fā)[A];中國生物工程學會第四次會員代表大會暨學術討論會論文摘要集[C];2005年

5 邵榮光;;抗感染抗體藥物的研究進展[A];2011年中國藥學大會暨第11屆中國藥師周論文集[C];2011年

6 陳志南;;抗體資源庫與工程抗體藥物[A];中國蛋白質組學第三屆學術大會論文摘要[C];2005年

7 沈倍奮;;靶向腫瘤的抗體藥物[A];2009醫(yī)學前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學術會議論文集[C];2009年

8 李萌;于傳飛;王蘭;張峰;劉春雨;王文波;郭瑋;高凱;王軍志;;抗體藥物偶聯(lián)物中藥物抗體偶聯(lián)比的測定[A];2013年中國藥學大會暨第十三屆中國藥師周論文集[C];2013年

9 吳衛(wèi)星;楊寧;張毓;王小寧;;單克隆抗體藥物的過去和未來[A];中國免疫學會第五屆全國代表大會暨學術會議論文摘要[C];2006年

10 甄永蘇;;抗體藥物與腫瘤靶向治療[A];第四屆中國腫瘤學術大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術會議教育集[C];2006年

中國重要報紙全文數據庫 前10條

1 本報記者 夏蘢;抗體藥物準確命中病變目標[N];泰州日報;2009年

2 記者 方芳　通訊員 王繼榮 王佳斌;北京抗體藥物研發(fā)平臺啟動[N];北京日報;2010年

3 記者 張曄　通訊員 劉月青;泰康生物制出自主產權抗體藥物[N];科技日報;2009年

4 本報記者 白毅;抗體藥物發(fā)展瓶頸待突破[N];中國醫(yī)藥報;2011年

5 記者 宦璐;抗體藥物全球市場2014年將超千億美元[N];上海證券報;2012年

6 記者 陶婷婷;我國抗體藥物產業(yè)發(fā)展瓶頸獲突破[N];上�？萍紙�;2012年

7 記者　 章迪思;滬產抗體類新藥厚積薄發(fā)[N];解放日報;2007年

8 胡德榮;上海4個抗體藥物通過驗收[N];健康報;2007年

9 劉揚;國內抗體藥物市場——銷售金額增長迅速 三資品牌掌控全局[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 白毅;抗體藥物研究與應用——發(fā)展前景看好[N];中國醫(yī)藥報;2007年

中國博士學位論文全文數據庫 前2條

1 余燕嵐;新型血管生長因子抗體藥物開發(fā)及抗腎腫瘤機制研究[D];浙江大學;2009年

2 唐U單

本文編號：389145