本文關(guān)鍵詞：EV71感染宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程中宿主因子作用的初步探究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)近些年來(lái)在中國(guó)大范圍流行,導(dǎo)致大量嬰幼兒患者死亡。腸道病毒71型(enterovirus71, EV71)被認(rèn)定為手足口病重癥和致死病例中最主要的病原體。EV71是小RNA病毒家族的成員之一,和其他小RNA病毒相似,EV71的基因組為一條長(zhǎng)約7.4kb的單股正鏈RNA,其中只有一個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF),在其ORF兩端分別有5’和3’非編碼區(qū)(untranslated regions,UTR)。在5’UTR區(qū)形成了高度保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草狀(clover leaf like)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop I)和一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribosome site,IRES)，根據(jù)現(xiàn)有的對(duì)其他小RNA病毒的研究結(jié)果提示,5’UTR區(qū)的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)與病毒的復(fù)制和翻譯有著密切的關(guān)系。一些宿主蛋白可以與病毒5’UTR的三葉草莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合,調(diào)控病毒的RNA復(fù)制過(guò)程；而IRES結(jié)構(gòu)可以在一些宿主蛋白以及IRES反式作用因子(IRES trans-acting factors,ITAFs)的共同作用下,以5’帽非依賴(lài)的方式起始病毒蛋白的翻譯過(guò)程。同時(shí),病毒基因組的3’UTR區(qū)被認(rèn)為與病毒基因組的穩(wěn)定和復(fù)制相關(guān)。 EV71是嗜神經(jīng)性腸道病毒,它可以感染宿主神經(jīng)系統(tǒng),引起無(wú)菌性腦脊髓膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、腦干腦炎等并發(fā)癥,重癥病例具有較高的死亡率。EV71病毒感染神經(jīng)細(xì)胞的分子機(jī)制是本實(shí)驗(yàn)室的研究重點(diǎn)。神經(jīng)細(xì)胞中哪些宿主蛋白參與了病毒復(fù)制和翻譯的調(diào)控過(guò)程——這是本文要解決的主要科學(xué)問(wèn)題。 在本文中我們首先構(gòu)建及改造EV71全長(zhǎng)cDNA感染性克隆。我們利用高保真RT-PCR技術(shù)成功將EV71全長(zhǎng)cDNA基因組裝入pBR322載體,構(gòu)建了EV71全長(zhǎng)cDNA克隆。將該克隆體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)染對(duì)EV71敏感的RD細(xì)胞株,通過(guò)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),用RT-PCR檢測(cè)EV71負(fù)鏈基因組以及空斑法鑒定,驗(yàn)證了該克隆具備感染性。隨后用空斑法建立了該感染性克隆拯救病毒的一步生長(zhǎng)曲線(one-step growth curve)。隨后我們運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)在EV715’UTR中的IRES結(jié)構(gòu)兩端分別引入了兩個(gè)單一的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(NsiI, XbaI),并驗(yàn)證了該突變株感染性克隆的感染性,為后續(xù)的替換或改造EV71IRES結(jié)構(gòu)以研究病毒的神經(jīng)嗜性實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。與此同時(shí),我們篩選了與5’UTR、3’UTR相互作用從而影響EV71翻譯或復(fù)制過(guò)程的宿主因子,特別是在EV71引起嚴(yán)重病變的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中影響該過(guò)程的宿主因子。我們將EV715’UTR及其分段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、3’UTR制備為生物素標(biāo)記的RNA探針,利用Biotin-pull down技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜分析,篩選出了兩個(gè)可以和EV715’UTR特異結(jié)合的宿主蛋白PCBP2和PTBP1.隨后我們使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及Western blot驗(yàn)證了PCBP2在翻譯水平上對(duì)EV71IRES介導(dǎo)的翻譯過(guò)程的調(diào)控,用Realtime RT-PCR技術(shù)初步驗(yàn)證了PCBP2對(duì)EV71RNA復(fù)制過(guò)程的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒71型 感染性克隆 5’非編碼區(qū) 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) IRES反式作用因子
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 引言8-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-22
• 實(shí)驗(yàn)方法22-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-58
• 討論58-60
• 小結(jié)60-61
• 不足與展望61-62
• 參考文獻(xiàn)62-70
• 綜述70-84
• 參考文獻(xiàn)80-84
• 附錄84-85
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷85-86
• 致謝86-88

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：EV71感染宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程中宿主因子作用的初步探究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：389084