本文關鍵詞：幽門螺桿菌甲硝唑耐藥相關rdxA基因突變特征及應用探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的： 抗生素耐藥已成為降低幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）根除治療成功率的最主要因素之一，闡明細菌耐藥機制愈發(fā)顯得重要。在H.pylori對甲硝唑耐藥機制研究領域，學者一致認為編碼氧不敏感硝基還原酶的rdxA和編碼黃素氧化還原酶的frxA基因發(fā)生突變是H.pylori對甲硝唑產(chǎn)生耐藥的主要機制。但對于frxA在耐藥中的貢獻存在爭論，近期研究表明rdxA突變通常是甲硝唑敏感株變?yōu)槟退幹晁匦璧模瑔为歠rxA失活并不足以誘導耐藥表型產(chǎn)生。英國和日本學者分析發(fā)現(xiàn)frxA失活同樣存在于敏感菌株中，因此推斷rdxA突變可能是承擔H.pylori甲硝唑耐藥表型的核心。然而，rdxA突變位點與耐藥表型之間的相關性尚不清楚。此外，大量臨床試驗和Maastricht Ⅳ共識都明確表明H.pylori甲硝唑體外藥敏試驗結果與臨床預后一致性較差，而CLSI（The Clinical andLaboratory Standards Institute）和EUCAST（European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing）規(guī)定8μg/ml為敏感性折點，該折點是否對于預測臨床治療結果最為合理，尚需進一步探討。為了探究這些問題，本研究將分析體外誘導的甲硝唑耐藥菌株中rdxA基因編碼氨基酸序列的突變特征，并分析1439株中國菌株甲硝唑MIC值分布特點，并與EUCAST數(shù)據(jù)庫中來自不同國家地區(qū)的11168株H. pylori甲硝唑MIC分布結果相比較，探討H.pylori對甲硝唑的耐藥機制。在此基礎上，聯(lián)合甲硝唑藥代動力學分析結果，對當前H.pylori甲硝唑敏感性折點的合理性展開討論。 方法： （1）體外篩選甲硝唑耐藥的H.pylori菌株：1×108CFU菌量的標準菌株H. pylori26695分別接種至含不同濃度甲硝唑的培養(yǎng)基上（A組：8μg/ml；B組：32μg/ml），培養(yǎng)3～5天； （2）挑取耐藥單克隆，擴大培養(yǎng)，收集并提取基因組DNA； （3）針對rdxA基因和frxA基因設計特異性全長測序引物； （4）擴增目的基因，擴增產(chǎn)物送測序； （5）生物信息學分析：AlignX和MEGA分析基因和氨基酸水平變化，SMART analysis service、DomPred、Swiss-Model server和Pymol分析蛋白質功能域和空間結構； （6）耐藥表型驗證：A組篩選菌株接種至含8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml和128μg/ml甲硝唑的平板；B組篩選菌株接種至含32μg/ml、64μg/ml和128μg/ml的甲硝唑的平板。37℃微需氧環(huán)境（5%O2、10%CO2和85%N2）培養(yǎng)2～4天，觀察生長情況； （7）菌株MIC測定：E-test（AB Biodisk，Sweden）法測定體外誘導耐藥菌株和來自中國的1439株臨床菌株的MIC，參照CLSI方法，H.pylori26695和ATCC43504作為質控菌株； （8）統(tǒng)計學分析先前研究中臨床菌株rdxA序列：pubmed和medline搜索關鍵詞“Helicobacter pylori”、“metronidazole”、“resistant”、“rdxA”、“minimuminhibitory concentration”。選擇具有rdxA基因序列和詳細MIC數(shù)據(jù)的研究作為分析對象。MIC值與RdxA截短之間的相關性采取卡方檢驗，P＜0.05為具有顯著性差異，SPSS16.0作為分析工具。 （9）計算當前幽門螺桿局根除療法中甲硝唑穩(wěn)態(tài)血藥峰濃度：利用Cssmax FD01ktmax公式計算。 結果： （1）共篩選38株耐藥菌（A組來源31株，B組來源7株），低濃度更易誘導耐藥表型獲得。提取獲得相應基因組，成功擴增并測序rdxA和frxA基因。分析發(fā)現(xiàn)rdxA基因均發(fā)生突變（突變率100%），而frxA僅在2株中發(fā)生同義突變（突變率5.3%）。 （2）氨基酸水平分析RdxA突變特征：根據(jù)基因序列翻譯成氨基酸序列并與親本菌株H.pylori26695RdxA比對，發(fā)現(xiàn)RdxA序列中所有突變位點均位于α（10～20th Aa）、β（30～80th Aa）和γ（140～180th Aa）區(qū)域，，分布率分別為13.2%、68.4%和18.4%，80～140位氨基酸區(qū)內(nèi)無突變發(fā)生。A組中21/3（167.7%）菌株其rdxA終止密碼子提前，蛋白截短，其余菌株（10/31，32.3%）僅含1個氨基酸突變；而B組中來源的所有7株菌其RdxA均截短，且所有的截短位點均位于α區(qū)�？偟膩碚f，突變位點主要位于β區(qū)，約82.1%（23/28）。 （3）結構分析突變的RdxA：截短位點位于56位氨基酸以前的RdxA無法預測到硝基還原酶結構域；以H.pylori26695RdxA為模板預測出38株菌中突變RdxA的3D模型，分析發(fā)現(xiàn)RdxA輔酶FMN的關鍵結合位點主要位于α、β和γ區(qū)，結構上看截短位置位于80位氨基酸之前的RdxA（A型模式）與FMN間的親和力較截短位置位于140位氨基酸后的RdxA（B型模式）減少更多，而某一個點突變的全長RdxA（C型模式）其與FMN的結合口袋受到的影響可能很小。 （4）含突變RdxA菌株的耐藥水平：A型突變模式菌株都能在超過64μg/ml的甲硝唑壓力下正常生長；B型突變模式菌株可在32μg/ml甲硝唑壓力下生長，但僅少數(shù)菌株可在64μg/ml壓力下存活；全部來自A組的C型模式突變菌株絕大多數(shù)僅可在32μg/ml以下抗生素濃度條件存活，除一株C148Y突變菌（驗證發(fā)現(xiàn)可存活于256μg/ml以上甲硝唑壓力條件）。 （5）MIC結果：A型、B型和C型突變模式菌株其MIC范圍分別為≥64μg/ml、≥32μg/ml以及8～32μg/ml（除C148Y突變株，MIC≥256μg/ml）。1439株來自中國的臨床菌株MIC呈現(xiàn)連續(xù)性分布，其中977株為耐藥菌（依據(jù)當前敏感性折點），耐藥率為67.89%。與EUCAST數(shù)據(jù)庫中11168株H.pylori的MIC分布比較發(fā)現(xiàn)，在中國近年來具有較高水平MIC的菌株所占比例較大。同時發(fā)現(xiàn)MIC為256μg/ml的菌株呈現(xiàn)集中分布特征態(tài)勢。 （6）既往研究中RdxA突變模式與MIC水平的相關性：2000～2012年10項研究中共194株臨床菌，分為兩組，即81株（MIC≤16μg/ml）和113株（MIC＞16μg/ml）。統(tǒng)計學處理發(fā)現(xiàn)兩組中RdxA截短的發(fā)生率有顯著性差異（9.88%vs56.64%，P＜0.001）。 （7）400mg tid和500mg tid時穩(wěn)態(tài)血藥峰濃度分別為20.1μg/ml和26.0μg/ml。這與當前敏感性折點8μg/ml不符，中國菌株中錯配比例超過12.5%（＞124/977）。 結論： （1）低濃度甲硝唑更易誘導獲得耐藥表型，rdxA基因突變是承擔甲硝唑耐藥的主要因素，而frxA基因突變對甲硝唑耐藥表型獲得的貢獻較小。 （2）RdxA突變存在3個熱點區(qū)，即α（10～20th Aa）、β（30～80th Aa）和γ（140～180th Aa）區(qū)，其中β區(qū)為主要突變區(qū)。構成FMN結合口袋的氨基酸突變或丟失可能會顯著影響蛋白質功能。此外，148位Cys可能對RdxA功能至關重要。 （3）RdxA突變模式與MIC水平具有一定的相關性：A型突變模式產(chǎn)生高水平耐藥；B型突變模式產(chǎn)生中度水平耐藥；C型突變模式主要產(chǎn)生低水平MIC。 （4）MIC分布在8～＜256μg/ml范圍呈現(xiàn)連續(xù)，而在256μg/ml呈現(xiàn)集中化，提示這可能是RdxA活性逐漸降低的過程，而MIC超過256μg/ml的菌株則獲得了全部耐藥機制。據(jù)此以及RdxA突變特征與MIC相關性，提出兩種耐藥類型：RdxA完全失活（Ⅰ型，質變）和部分失活（Ⅱ型，量變）。建議臨床上MIC≥256μg/ml的菌株，完全放棄使用甲硝唑作為根除療法的組分。 （5）結合藥代動力學數(shù)據(jù)、MIC分布特征及耐藥機制證實當前H.pylori敏感性折點不合理。 （6）建議設計以下臨床試驗確定具體合理的敏感性折點：①不同甲硝唑給藥方式，如1.5g qd和500mg tid，在相同藥物組合、劑量和療程中比較H.pylori的根除差異；②明確不同MIC水平對含甲硝唑的三聯(lián)或四聯(lián)療法根除率的影響；③相同甲硝唑給藥方式在與不同抗生素組合時對H.pylori（MIC相同）根除率的影響。
【關鍵詞】：幽門螺桿菌 甲硝唑 rdxA 最小抑菌濃度 敏感性折點
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：Q78;R378
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-16
• 第1章 引言16-19
• 第2章 rdxA 基因在幽門螺桿菌甲硝唑耐藥中的突變特征19-34
• 2.1 材料與方法19-26
• 2.1.1 材料19-20
• 2.1.2 方法20-26
• 2.2 結果26-32
• 2.2.1 體外誘導耐藥單克隆菌26
• 2.2.2 目的基因擴增結果26-27
• 2.2.3 序列分析結果27-29
• 2.2.4 結構預測及分析結果29-31
• 2.2.5 不同突變模式耐藥表型驗證實驗結果31
• 2.2.6 38 株體外誘導耐藥菌株的 MIC 結果31
• 2.2.7 統(tǒng)計學分析 RdxA 截短與耐藥水平相關性結果31-32
• 2.3 討論32-33
• 2.4 結論33-34
• 第3章 對當前幽門螺桿菌甲硝唑敏感性折點合理性的探討34-40
• 3.1 材料與方法34-36
• 3.1.1 材料34-35
• 3.1.2 方法35-36
• 3.2 結果36-37
• 3.2.1 中國來源 1439 株 H.pylori 的藥敏結果及與 EUCAST 數(shù)據(jù)的比較36-37
• 3.2.2 當前常用根除療法中 MTZ 血藥峰濃度37
• 3.3 討論37-39
• 3.4 結論39-40
• 致謝40-41
• 參考文獻41-45
• 攻讀學位期間的研究成果45-46
• 綜述46-52
• 參考文獻50-52

  本文關鍵詞：幽門螺桿菌甲硝唑耐藥相關rdxA基因突變特征及應用探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：388973