本文關(guān)鍵詞：MIPU1對(duì)阿霉素所致HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：阿霉素(Doxorubicin, DOX)是臨床上用于治療腫瘤的化療藥物,但是阿霉素存在很大的毒副作用,如阿霉素心肌病,阿霉素腎病等。這些毒副作用主要和細(xì)胞凋亡有關(guān)。Mipu1是本科室發(fā)現(xiàn)的一個(gè)缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的新基因(GenBank登錄號(hào)為AY221750),并已證實(shí)Mipu1是一種KRAB型鋅指蛋白,具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。通過生物信息學(xué)比對(duì),發(fā)現(xiàn)Mipu1結(jié)構(gòu)上十分保守,在嚙類動(dòng)物和人之間具有相當(dāng)高的同源性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、P53、Bid、Bak等的啟動(dòng)子區(qū)含有Mipu1的核心結(jié)合位點(diǎn)。然而,Mipu1是否可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)上述凋亡相關(guān)基因表達(dá),從而減輕DOX的細(xì)胞毒性作用并不清楚。因此,本研究擬在探討MIPU1對(duì)DOX所致細(xì)胞凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制,以期為深入闡明新基因Mipu1的生物學(xué)功能提供新的證據(jù),為預(yù)防DOX抗腫瘤治療過程中的毒副作用提供新的思路。 方法：本次實(shí)驗(yàn)以DOX誘導(dǎo)人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)凋亡為模型,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MIPU1真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-MIPU1,使細(xì)胞過表達(dá)MIPU1。實(shí)驗(yàn)分為四組,即pEGFP組、MIPU1組、pEGFP+DOX組和MIPU1+DOX組。(1)采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察DOX處理下MIPU1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞存活率的影響；(2)采用Hoechst33258染色、Caspase-3活性檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)分析MIPU1過表達(dá)對(duì)DOX所致細(xì)胞凋亡的影響；(3)采用Western blot和RT-PCR分析MIPU1過表達(dá)對(duì)DOX所致抗凋亡基因Bcl-2.促凋亡基因P53和Bax在蛋白和mRNA水平表達(dá)變化的影響；(5)采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析MIPU1對(duì)Bax啟動(dòng)子活性的影響。 結(jié)果：(1)HEK293細(xì)胞經(jīng)過DOX處理后細(xì)胞存活率明顯下降(p0.01VS pEGFP);當(dāng)轉(zhuǎn)染pEGFP-MIPU1使細(xì)胞過表達(dá)MIPU1后,DOX所致的細(xì)胞死亡被明顯抑制(P0.05VS pEGFP+DOX)。(2)HEK293細(xì)胞經(jīng)過DOX處理后細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.01VSpEGFP)；過表達(dá)MIPU1則明顯抑制DOX所致的細(xì)胞凋亡率的增加(P0.01VS pEGFP+DOX)=(3)DOX處理HEK293細(xì)胞后,Bcl-2的表達(dá)明顯減少(P0.05VS pEGFP);但是過表達(dá)MIPU1后Bcl-2的表達(dá)則明顯增多(P0.05VS pEGFP+DOX)。(4) HEK293細(xì)胞經(jīng)過DOX處理后,Bax和P53的表達(dá)明顯增多(P0.05VSpEGFP);過表達(dá)MIPU1后,Bax和P53的表達(dá)則明顯下降(P0.05VS pEGFP+DOX)。(5)將含有Bax啟動(dòng)子的報(bào)告基因與pEGFP-MIPU1共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性明顯下降,且兩者呈量效關(guān)系,當(dāng)Bax啟動(dòng)子發(fā)生突變后,則熒光素酶活性不受影響(P0.01VS pEGFP)。 結(jié)論：(1)MIPU1過表達(dá)對(duì)DOX引起的HEK293細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用；(2)其機(jī)制可能與抑制DOX導(dǎo)致的Bcl-2的減少、P53和Bax的增多有關(guān)；(3)MIPU1能抑制Bax基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,其抑制作用可能依賴于MIPU1的特異性結(jié)合位點(diǎn)。圖23幅,參考文獻(xiàn)45篇。
【關(guān)鍵詞】：HEK293 阿霉素 細(xì)胞凋亡 MIPU1 Bax P53 Bcl-2
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目錄9-11
• 符號(hào)說明11-12
• 1 緒論12-16
• 2 材料與方法16-24
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 主要材料和試劑16
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器16-17
• 2.1.3 引物序列17
• 2.2 方法17-23
• 2.2.1 HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)及處理17
• 2.2.2 轉(zhuǎn)化17-18
• 2.2.3 質(zhì)粒的提取18
• 2.2.4 pEGFP-MIPU1真核表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定18
• 2.2.5 pEGFP-MIPU1質(zhì)粒測(cè)序18-19
• 2.2.6 脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染19
• 2.2.7 細(xì)胞總RNA提取19
• 2.2.8 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)步驟19-20
• 2.2.9 BCA蛋白定量20-21
• 2.2.10 細(xì)胞總蛋白的提取和蛋白質(zhì)免疫印跡分析21
• 2.2.11 Hoechst33258染核,檢測(cè)細(xì)胞核凋亡形態(tài)及凋亡百分率計(jì)算21
• 2.2.12 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率21-22
• 2.2.13 流式細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡22
• 2.2.14 Caspase-3活性檢測(cè)22-23
• 2.2.15 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)23
• 2.3 結(jié)果分析23-24
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-45
• 3.1 DOX對(duì)HEK293細(xì)胞中MIPU1表達(dá)的影響24-25
• 3.2 檢測(cè)MIPU1的轉(zhuǎn)染效率25-28
• 3.2.1 MIPU1真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定25
• 3.2.2 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果25-26
• 3.2.3 MIPU1的轉(zhuǎn)染與表達(dá)26-28
• 3.3 MIPU1對(duì)DOX所致細(xì)胞存活率的影響28-30
• 3.3.1 MTT檢測(cè)不同濃度DOX處理HEK293細(xì)胞24h對(duì)細(xì)胞活性的影響28-29
• 3.3.2 MTT檢測(cè)過表達(dá)MIPU1對(duì)細(xì)胞存活率的影響29-30
• 3.4 MIPU1過表達(dá)對(duì)DOX所致細(xì)胞凋亡的影響30-34
• 3.4.1 Hoechst33258染核觀察過表達(dá)MIPU1后細(xì)胞凋亡的變化情況30-31
• 3.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)1μDOX處理后的細(xì)胞凋亡率31-32
• 3.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MIPU1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響32-34
• 3.4.4 檢測(cè)MIPU1過表達(dá)對(duì)Caspase-3活性的影響34
• 3.5 MIPU1過表達(dá)對(duì)DOX所致Bcl-2表達(dá)的影響34-37
• 3.5.1 不同濃度DOX處理HEK293細(xì)胞24小時(shí)后Bcl-2蛋白的表達(dá)變化34-35
• 3.5.2 1μMDOX處理HEK293細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后Bcl-2蛋白的表達(dá)變化35-36
• 3.5.3 過表達(dá)MIPU1對(duì)DOX所致Bcl-2在mRNA水平上的變化36
• 3.5.4 MIPU1過表達(dá)在蛋白水平上對(duì)Bcl-2的表達(dá)變化36-37
• 3.6 過表達(dá)MIPU1對(duì)P53表達(dá)的影響37-40
• 3.6.1 濃度DOX處理后p53在蛋白水平上的變化37-38
• 3.6.2 觀察在DOX刺激下P53在mRNA水平上的變化38
• 3.6.3 MIPU1過表達(dá)后對(duì)DOX所致P53的mRNA表達(dá)的影響38-39
• 3.6.4 MIPU1過表達(dá)對(duì)DOX所致p53蛋白表達(dá)水平的影響39-40
• 3.7 MIPU1過表達(dá)對(duì)Bax表達(dá)的影響40-45
• 3.7.1 不同濃度DOX處理HEK293細(xì)胞24小時(shí)后Bax蛋白的表達(dá)變化40
• 3.7.2 1μgM DOX處理HEK293細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后Bax蛋白的表達(dá)變化40-41
• 3.7.3 MIPUl過表達(dá)對(duì)DOX所致Bax在mRNA水平上表達(dá)的變化41-42
• 3.7.4 Western blot檢測(cè)MIPU1過表達(dá)對(duì)DOX所致Bax在蛋白水平上的表達(dá)變化42-43
• 3.7.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)MIPU1對(duì)Bax基因是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用43-45
• 4 分析與討論45-48
• 5 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 綜述53-64
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 附錄64-69
• 攻讀學(xué)位期間主要研究成果69-70
• 致謝70-71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 高敏;王浩;劉瑛;涂自智;劉梅冬;陳廣文;劉可;;Mipu1基因在內(nèi)毒素血癥小鼠組織中的表達(dá)研究[J];生命科學(xué)研究;2010年04期

2 屈順林;郭芳;范文靜;張弛;詹向陽;姜志勝;;心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷時(shí)Mipu1啟動(dòng)子活性、Mipu1 mRNA表達(dá)變化及意義[J];山東醫(yī)藥;2012年23期

3 孫良忠,岳智慧,湯潔如,陳述枚,許韓師,陶瑜,關(guān)偉明;細(xì)胞凋亡在阿霉素腎病大鼠腎小球硬化過程中的意義[J];中華兒科雜志;2000年05期

  本文關(guān)鍵詞：MIPU1對(duì)阿霉素所致HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：387273