本文關(guān)鍵詞：Ad5-GFP的大規(guī)模擴(kuò)增、純化及生物活性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索腺病毒大規(guī)模擴(kuò)增的條件、細(xì)胞破碎的最優(yōu)方法、硫酸銨沉淀的最適濃度、疏水柱及離子交換柱聯(lián)用純化腺病毒的最佳工藝、腺病毒最佳的保存條件、最后通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究純化后的腺病毒活性。 方法：以腺病毒的滴度、純度和回收率來(lái)考察最后的結(jié)果。 一、比較不同MOI值、感染時(shí)間下腺病毒的滴度，用于確定大規(guī)模擴(kuò)增的最佳條件。 二、比較反復(fù)凍融法、超聲波法和高壓滲透壓法后腺病毒的滴度，確定細(xì)胞破碎的最佳方法。 三、配置不同百分比的飽和硫酸銨來(lái)沉淀腺病毒，比較回收率后確定最適合的飽和硫酸銨濃度。 四、比較不同疏水柱類(lèi)型和鹽濃度、陰離子交換柱的類(lèi)型，通過(guò)腺病毒的滴度、純度和回收率來(lái)確定最適合的工藝條件。 五、采用正交設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)的方法確定腺病毒的最適合保存條件。 六、通過(guò)ELISA法比較純化前后腺病毒在體內(nèi)體外綠色熒光蛋白的表達(dá)量，以及蛋白的表達(dá)量隨腺病毒感染的滴度、時(shí)間的變化。 本實(shí)驗(yàn)參考了相關(guān)文獻(xiàn)后，設(shè)計(jì)了用硫酸銨沉淀法將腺病毒上清中的腺病毒濃縮粗純，不經(jīng)過(guò)處理直接上疏水柱，再過(guò)離子交換柱的辦法來(lái)純化腺病毒，最后通過(guò)體內(nèi)體外比較純化前后的蛋白表達(dá)量。 結(jié)果： 一、腺病毒大規(guī)模擴(kuò)增的最佳條件為：MOI值為10、感染時(shí)間為24小時(shí)，收獲的腺病毒滴度最高。 二、比較反復(fù)凍融法、超聲波法和高壓滲透壓法發(fā)現(xiàn)超聲波法破碎細(xì)胞的效果最好，破損率等達(dá)到96%。 三、通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硫酸銨沉淀法最適合濃度為60%的飽和硫酸銨，回收率能達(dá)到70%。 四、使用美國(guó)GE Healthcare公司的Sepharose High Performance柱，在平衡緩沖液A液：2.5M（NH4）2SO4，40mM Tris-Hcl(pH8.0)、5%甘油、1mM MgCl2；洗脫緩沖液B液：40mM Tris-Hcl(pH8.0)、5%甘油、1mM MgCl2下梯度洗脫20個(gè)柱體積，腺病毒回收率為79.6%。 五、使用陰離子交換柱Q xl，，在平衡平衡緩沖液A液：40mM Tris-Hcl(pH=8.0)、5%甘油、1mM MgCl2；平衡緩沖液B液：1M NaCl，40mM Tris-Hcl(pH=8.0)、5%甘油、1mM MgCl2下，梯度洗脫20個(gè)柱體積，腺病毒回收率為92.3%。最后的總回收率達(dá)到53.7%，純度為91.0%。 六、腺病毒的最適合保存條件為；-80度、5%甘油、1mM MgCl2。 七、純化后的腺病毒表達(dá)的的綠色熒光蛋白的表達(dá)量要高于純化前的。 結(jié)論：通過(guò)腺病毒硫酸銨沉淀、過(guò)疏水柱再過(guò)離子交換柱的辦法來(lái)純化腺病毒的辦法得到的腺病毒沉淀與傳統(tǒng)的CsCl密度梯度離心法類(lèi)似、但回收率高于后者。因此本方法好于傳統(tǒng)的CsCl密度梯度離心法。同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明純化后的腺病毒活性要好于純化前。本實(shí)驗(yàn)提供一種腺病毒擴(kuò)增及純化的方法，及腺病毒保存及注射的最佳條件，可以給其他腺病毒基因藥物的方面的研究提供借鑒。
【關(guān)鍵詞】：腺病毒 大規(guī)模擴(kuò)增 純化 純度 回收率
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R346
【目錄】：

• 目錄4-6
• 縮略語(yǔ)6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一章 腺病毒大規(guī)模擴(kuò)增及層析前處理研究14-34
• 1.1 引言14-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 1.2.1 試劑17-18
• 1.2.2 儀器18-19
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑的配制19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法19-27
• 1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇19
• 1.3.2 細(xì)胞傳代19-20
• 1.3.3 十層板大規(guī)模培養(yǎng) 293 細(xì)胞20-21
• 1.3.4 不同 MOI 值的腺病毒感染 293 細(xì)胞后滴度的比較21
• 1.3.5 腺病毒感染 293 細(xì)胞不同時(shí)間后滴度的比較21
• 1.3.6 細(xì)胞破碎方法的研究21-22
• 1.3.7 病毒上清硫酸銨沉淀濃度摸索22-23
• 1.3.8 病毒釋放量指標(biāo)的檢測(cè)23-27
• 1.4 結(jié)果27-32
• 1.4.1 不同 MOI 值的腺病毒感染 HEK-293 細(xì)胞后滴度的比較27-28
• 1.4.2 腺病毒感染 293 細(xì)胞不同時(shí)間后滴度的比較28-30
• 1.4.3 不同破碎方法結(jié)果比較30-31
• 1.4.4 不同硫酸銨濃度沉淀腺病毒的上清結(jié)果比較31-32
• 1.5 小結(jié)32-34
• 第二章 層析工藝方法的優(yōu)化34-54
• 2.1 引言34-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 2.2.1 試劑36
• 2.2.2 儀器36-37
• 2.2.3 試劑的配制37
• 2.3 腺病毒柱層析方法研究37-44
• 2.3.1 疏水柱層析工藝研究37-39
• 2.3.2 離子交換柱層析工藝研究39-40
• 2.3.3 腺病毒純度的檢測(cè)40-41
• 2.3.4 腺病毒回收率的檢測(cè)41
• 2.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)摸索腺病毒保存的最適合條件41-42
• 2.3.6 純化前后腺病毒感染 293 細(xì)胞后 GFP 的表達(dá)情況42-44
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-52
• 2.4.1 疏水填料的結(jié)果44-48
• 2.4.2 不同離子交換柱填料類(lèi)型的結(jié)果48-50
• 2.4.3 最終純化后腺病毒 A260/A280 的結(jié)果50
• 2.4.4 最終純化后腺病毒 monQ 的結(jié)果50-51
• 2.4.5 不同配方保存腺病毒的結(jié)果51-52
• 2.5 小結(jié)52-54
• 實(shí)驗(yàn)討論54-57
• 參考文獻(xiàn)57-66
• 發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

【相似文獻(xiàn)】

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