本文關(guān)鍵詞：一種新的人突變SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立和臨床表型研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 肌萎縮側(cè)索硬化癥，也稱(chēng)“盧伽雷氏病”或“漸凍人癥”，是以上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性為主要特征的一種神經(jīng)變性疾病。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在A(yíng)LS患者病灶中有不溶性蛋白質(zhì)的沉積，臨床可表現(xiàn)為進(jìn)行性的運(yùn)動(dòng)功能障礙、吞咽困難、骨骼肌萎縮等，常在發(fā)病后3~5年內(nèi)死亡。這種疾病廣泛發(fā)生于世界各地，按照有無(wú)家族性遺傳背景，可分為FALS和SALS。目前除力如太能稍延緩病情進(jìn)展外，尚無(wú)有效的治療方式。因此有必要對(duì)ALS進(jìn)行深入研究，揭示其發(fā)病機(jī)制，為治療和預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。 80～90%的ALS為SALS，另外10～20％的患者為具有家族性遺傳背景的FALS。FALS與SALS均表現(xiàn)為同時(shí)存在上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損害的體征，具有相似的肌電圖特征，病理學(xué)組織學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害的依據(jù)。因此，F(xiàn)ALS是很好的研究ALS發(fā)病機(jī)制研究的疾病模型。FALS患者中約20%是由Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，SOD1)突變引起的。在有氧生物體內(nèi)，SOD1主要催化O2-+O2+2H+→H2O2+O2，是催化超氧化陰離子歧化作用的主要酶類(lèi)，。自1993年Rosen首次報(bào)道FALS發(fā)病與SOD1突變相關(guān)以來(lái)[1]，目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)160種與ALS的發(fā)病相關(guān)的SOD1基因突變類(lèi)型(http://alsod.iop.kcl.ac.uk/)。以突變SOD1為基礎(chǔ)建立起來(lái)的細(xì)胞和動(dòng)物模型被廣泛用于A(yíng)LS的研究。 錯(cuò)義突變占到SOD1的突變類(lèi)型的大多數(shù)，即表達(dá)蛋白中某個(gè)氨基酸被替換，其中93位的甘氨酸→丙氨酸(Gly→Ala，G93A)突變?yōu)槌Ｒ?jiàn)的突變之一。有少數(shù)為非錯(cuò)義突變，即突變導(dǎo)致翻譯提前終止，編碼蛋白分子的一段序列缺失。由于在病程、發(fā)病年齡、病情嚴(yán)重程度上不同的FALS患者，其SOD1基因突變類(lèi)型也不同。因此，突變SOD1的基因型可能是決定患者臨床表型的主要因素。 最初的研究認(rèn)為，由于SOD1基因突變，SOD1功能喪失(loss-of-function)，從而導(dǎo)致酶活性下降，抗氧化作用減弱，活性氧濃度升高，從而引起神經(jīng)元損傷[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，SOD1基因突變導(dǎo)致的ALS患者紅細(xì)胞內(nèi)SOD1活性較正常人下降約50～60%，而突變SOD1基因攜帶者紅細(xì)胞內(nèi)SOD1活性也明顯降低。通過(guò)對(duì)敲除SOD1基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，敲除SOD1基因后，小鼠沒(méi)有出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害。說(shuō)明突變SOD1的細(xì)胞毒性作用可能是由于功能獲得(gain-of-function)，即突變的SOD1獲得的一些新功能，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損害[1,2]。研究認(rèn)為突變SOD1構(gòu)象不穩(wěn)定，易發(fā)生去折疊，引起突變蛋白聚集物的形成，可以通過(guò)自身與其它蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)生理病理改變。 史樹(shù)貴教授的研究小組在重慶地區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)涉及4代，受累患者多達(dá)14人的ALS大家系，為常染色體顯性遺傳，其臨床表型特殊，與目前文獻(xiàn)報(bào)道不完全一致。對(duì)該家系成員基因組進(jìn)行聚合酶鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、測(cè)序，發(fā)現(xiàn)部分家系成員的2號(hào)外顯子編碼區(qū)發(fā)生了堿基插入突變，導(dǎo)致閱讀框改變，轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤，使2號(hào)外顯子的32個(gè)氨基酸殘基縮短為12個(gè)，突變后的SOD1蛋白質(zhì)為由35個(gè)氨基酸組成的短肽[3]。這是一種新的SOD1基因突變類(lèi)型(mSOD1, GeneBank:EF143990.1)。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們已證實(shí)表達(dá)該突變SOD1后，神經(jīng)元的活性顯著下降，神經(jīng)元出現(xiàn)損傷的形態(tài)學(xué)改變。同時(shí)，我們獲得了該突變SOD1基因(mutant SOD1，mSOD1)編碼的蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。我們準(zhǔn)備通過(guò)構(gòu)建mSOD1基因表達(dá)載體，將其注入小鼠受精卵細(xì)胞，移植于假孕母鼠中，獲得表達(dá)mSOD1的轉(zhuǎn)基因小鼠，為后續(xù)深入研究ALS的致病機(jī)制提供較好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠臨床表型和功能檢測(cè)，可以初步明確該SOD1突變類(lèi)型在重慶市這一具有特殊臨床表型ALS家系發(fā)病中的作用。 目的 通過(guò)原核顯微注射技術(shù)，構(gòu)建一種新的表達(dá)人mSOD1的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。通過(guò)運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)、病理學(xué)研究、蛋白組學(xué)研究、免疫組化等方法，觀(guān)察轉(zhuǎn)基因小鼠的臨床表型，從而初步明確該mSOD1類(lèi)型與ALS的發(fā)病關(guān)系。 方法 構(gòu)建攜帶mSOD1基因的PCI質(zhì)粒載體，用受精卵原核顯微注射的方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。利用PCR方法鑒定出生的后代，通過(guò)懸尾實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)、足跡分析等檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)功能，Western-Blot檢測(cè)小鼠脊髓及皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元mSOD1蛋白表達(dá)，免疫組化技術(shù)檢測(cè)mSOD1在轉(zhuǎn)基因鼠小鼠脊髓及皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)，使用透射電子顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的脊髓及皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行超微病理研究。 結(jié)果 PCR結(jié)果證實(shí)獲得了表達(dá)人mSOD1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中首建鼠2只， F1代鼠2只，F(xiàn)2代鼠2只，F(xiàn)3代鼠1只。在出生后240d左右，mSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙。行為學(xué)檢測(cè)顯示，mSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中雙下肢不能充分伸展，不能翻轉(zhuǎn)身體。mSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠在轉(zhuǎn)輪上停留的時(shí)間為59.17±26.27sec，野生型小鼠為171.83±20.98sec，轉(zhuǎn)基因小鼠停留時(shí)間明顯短于野生型小鼠(P0.01)。足跡分析顯示轉(zhuǎn)基因小鼠在出生8月左右出現(xiàn)雙下肢跛行、拖曳，足跡欠規(guī)整，轉(zhuǎn)基因小鼠后肢足間距測(cè)量結(jié)果為34.83±9.72mm，野生型小鼠后肢足間距測(cè)量結(jié)果為52.78±7.22mm，轉(zhuǎn)基因小鼠后肢足間距明顯小于野生型小鼠(P0.01)。Western-Blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓和皮層中均表達(dá)了mSOD1蛋白，免疫組化結(jié)果顯示在脊髓和皮層神經(jīng)元胞漿中有mSOD1表達(dá)，透射電鏡觀(guān)察到其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞質(zhì)中可見(jiàn)不溶性致密嗜鋨酸顆粒沉積。 結(jié)論 我們成功地構(gòu)建了mSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了類(lèi)似ALS的臨床表型，說(shuō)明該突變SOD1類(lèi)型是ALS發(fā)病的一種新的致病基因。
【關(guān)鍵詞】：肌萎縮側(cè)索硬化癥 超氧化物歧化酶 轉(zhuǎn)基因小鼠
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R744.8;R-332
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• Abstract5-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 表達(dá)人突變 SOD1 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立15-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-21
• 2.3 結(jié)果21-24
• 2.4 討論24-27
• 第三章 表達(dá)人突變 SOD1 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的臨床表型研究27-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象27
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法28-37
• 3.4 結(jié)果37-42
• 3.5 討論42-48
• 全文總結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 文獻(xiàn)綜述 ALS 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究進(jìn)展52-67
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 在讀期間發(fā)表文章67-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 胡俊,史樹(shù)貴,李露斯,吳玉章,倪兵;肌萎縮側(cè)索硬化癥家系銅鋅超氧化物歧化酶基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2005年11期

2 胡俊,李露斯,吳玉章,倪兵,史樹(shù)貴;構(gòu)建具有突變銅-鋅超氧化物歧化酶綠色熒光真核表達(dá)載體[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年29期

3 席靜;張成;盧錫林;謝有梅;李洵華;李寶琴;黃慧;;家族性ALS的臨床特征及基因分析[J];中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志;2006年01期

4 史樹(shù)貴,李露斯,陳康寧,劉昕;一個(gè)肌萎縮側(cè)索硬化家系的SOD1基因突變[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2004年02期

5 吳成斯;邵蓓;徐仁O5;;肌萎縮側(cè)索硬化一家系的臨床特征及SOD1基因分析[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2009年05期

6 盧錫林;姚曉黎;張成;李洵樺;;肌萎縮側(cè)索硬化癥SOD1基因突變特點(diǎn)[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2006年01期

7 陰均濤;張紅麗;閆欣;王亞飛;劉亞玲;;不同行為學(xué)測(cè)試方法在家族性肌萎縮側(cè)索硬化小鼠模型的比較[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2013年01期

  本文關(guān)鍵詞：一種新的人突變SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立和臨床表型研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：383332