本文關鍵詞：一種新的人突變SOD1轉基因小鼠模型的建立和臨床表型研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 肌萎縮側索硬化癥，也稱“盧伽雷氏病”或“漸凍人癥”，是以上、下運動神經元變性為主要特征的一種神經變性疾病。病理學研究發(fā)現，在ALS患者病灶中有不溶性蛋白質的沉積，臨床可表現為進行性的運動功能障礙、吞咽困難、骨骼肌萎縮等，常在發(fā)病后3~5年內死亡。這種疾病廣泛發(fā)生于世界各地，按照有無家族性遺傳背景，可分為FALS和SALS。目前除力如太能稍延緩病情進展外，尚無有效的治療方式。因此有必要對ALS進行深入研究，揭示其發(fā)病機制，為治療和預防提供理論基礎。 80～90%的ALS為SALS，另外10～20％的患者為具有家族性遺傳背景的FALS。FALS與SALS均表現為同時存在上、下運動神經損害的體征，具有相似的肌電圖特征，病理學組織學檢查可發(fā)現上、下運動神經元損害的依據。因此，FALS是很好的研究ALS發(fā)病機制研究的疾病模型。FALS患者中約20%是由Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，SOD1)突變引起的。在有氧生物體內，SOD1主要催化O2-+O2+2H+→H2O2+O2，是催化超氧化陰離子歧化作用的主要酶類，。自1993年Rosen首次報道FALS發(fā)病與SOD1突變相關以來[1]，目前已發(fā)現超過160種與ALS的發(fā)病相關的SOD1基因突變類型(http://alsod.iop.kcl.ac.uk/)。以突變SOD1為基礎建立起來的細胞和動物模型被廣泛用于ALS的研究。 錯義突變占到SOD1的突變類型的大多數，即表達蛋白中某個氨基酸被替換，其中93位的甘氨酸→丙氨酸(Gly→Ala，G93A)突變?yōu)槌Ｒ姷耐蛔冎弧Ｓ猩贁禐榉清e義突變，即突變導致翻譯提前終止，編碼蛋白分子的一段序列缺失。由于在病程、發(fā)病年齡、病情嚴重程度上不同的FALS患者，其SOD1基因突變類型也不同。因此，突變SOD1的基因型可能是決定患者臨床表型的主要因素。 最初的研究認為，由于SOD1基因突變，SOD1功能喪失(loss-of-function)，從而導致酶活性下降，抗氧化作用減弱，活性氧濃度升高，從而引起神經元損傷[1]。臨床研究發(fā)現，SOD1基因突變導致的ALS患者紅細胞內SOD1活性較正常人下降約50～60%，而突變SOD1基因攜帶者紅細胞內SOD1活性也明顯降低。通過對敲除SOD1基因小鼠的研究發(fā)現，敲除SOD1基因后，小鼠沒有出現運動神經元損害。說明突變SOD1的細胞毒性作用可能是由于功能獲得(gain-of-function)，即突變的SOD1獲得的一些新功能，從而導致神經元損害[1,2]。研究認為突變SOD1構象不穩(wěn)定，易發(fā)生去折疊，引起突變蛋白聚集物的形成，可以通過自身與其它蛋白質發(fā)生相互作用導致機體出現生理病理改變。 史樹貴教授的研究小組在重慶地區(qū)發(fā)現一個涉及4代，受累患者多達14人的ALS大家系，為常染色體顯性遺傳，其臨床表型特殊，與目前文獻報道不完全一致。對該家系成員基因組進行聚合酶鏈-單鏈構象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、測序，發(fā)現部分家系成員的2號外顯子編碼區(qū)發(fā)生了堿基插入突變，導致閱讀框改變，轉錄和翻譯時發(fā)生錯誤，使2號外顯子的32個氨基酸殘基縮短為12個，突變后的SOD1蛋白質為由35個氨基酸組成的短肽[3]。這是一種新的SOD1基因突變類型(mSOD1, GeneBank:EF143990.1)。在前期實驗中，我們已證實表達該突變SOD1后，神經元的活性顯著下降，神經元出現損傷的形態(tài)學改變。同時，我們獲得了該突變SOD1基因(mutant SOD1，mSOD1)編碼的蛋白的二級和三級結構。我們準備通過構建mSOD1基因表達載體，將其注入小鼠受精卵細胞，移植于假孕母鼠中，獲得表達mSOD1的轉基因小鼠，為后續(xù)深入研究ALS的致病機制提供較好的實驗模型。通過對轉基因小鼠臨床表型和功能檢測，可以初步明確該SOD1突變類型在重慶市這一具有特殊臨床表型ALS家系發(fā)病中的作用。 目的 通過原核顯微注射技術，構建一種新的表達人mSOD1的轉基因小鼠模型。通過運動功能檢測、病理學研究、蛋白組學研究、免疫組化等方法，觀察轉基因小鼠的臨床表型，從而初步明確該mSOD1類型與ALS的發(fā)病關系。 方法 構建攜帶mSOD1基因的PCI質粒載體，用受精卵原核顯微注射的方法制備轉基因小鼠。利用PCR方法鑒定出生的后代，通過懸尾實驗、轉輪實驗、曠場試驗、足跡分析等檢測小鼠運動功能，Western-Blot檢測小鼠脊髓及皮層運動神經元mSOD1蛋白表達，免疫組化技術檢測mSOD1在轉基因鼠小鼠脊髓及皮層運動神經元內的表達，使用透射電子顯微鏡對轉基因小鼠的脊髓及皮層運動神經元進行超微病理研究。 結果 PCR結果證實獲得了表達人mSOD1基因的轉基因小鼠，其中首建鼠2只， F1代鼠2只，F2代鼠2只，F3代鼠1只。在出生后240d左右，mSOD1轉基因小鼠出現運動功能障礙。行為學檢測顯示，mSOD1轉基因小鼠在懸尾實驗中雙下肢不能充分伸展，不能翻轉身體。mSOD1轉基因小鼠在轉輪上停留的時間為59.17±26.27sec，野生型小鼠為171.83±20.98sec，轉基因小鼠停留時間明顯短于野生型小鼠(P0.01)。足跡分析顯示轉基因小鼠在出生8月左右出現雙下肢跛行、拖曳，足跡欠規(guī)整，轉基因小鼠后肢足間距測量結果為34.83±9.72mm，野生型小鼠后肢足間距測量結果為52.78±7.22mm，轉基因小鼠后肢足間距明顯小于野生型小鼠(P0.01)。Western-Blot結果顯示在轉基因小鼠脊髓和皮層中均表達了mSOD1蛋白，免疫組化結果顯示在脊髓和皮層神經元胞漿中有mSOD1表達，透射電鏡觀察到其運動神經元胞質中可見不溶性致密嗜鋨酸顆粒沉積。 結論 我們成功地構建了mSOD1轉基因小鼠，轉基因小鼠出現了類似ALS的臨床表型，說明該突變SOD1類型是ALS發(fā)病的一種新的致病基因。
【關鍵詞】：肌萎縮側索硬化癥 超氧化物歧化酶 轉基因小鼠
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R744.8;R-332
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 表達人突變 SOD1 的轉基因小鼠模型的建立15-27
• 2.1 實驗材料15-16
• 2.2 實驗方法16-21
• 2.3 結果21-24
• 2.4 討論24-27
• 第三章 表達人突變 SOD1 的轉基因小鼠模型的臨床表型研究27-48
• 3.1 實驗對象27
• 3.2 實驗材料27-28
• 3.3 實驗方法28-37
• 3.4 結果37-42
• 3.5 討論42-48
• 全文總結48-49
• 參考文獻49-52
• 文獻綜述 ALS 轉基因動物模型研究進展52-67
• 參考文獻61-67
• 在讀期間發(fā)表文章67-68
• 致謝68

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前7條

1 胡俊,史樹貴,李露斯,吳玉章,倪兵;肌萎縮側索硬化癥家系銅鋅超氧化物歧化酶基因突變位點的檢測[J];醫(yī)學研究生學報;2005年11期

2 胡俊,李露斯,吳玉章,倪兵,史樹貴;構建具有突變銅-鋅超氧化物歧化酶綠色熒光真核表達載體[J];中國臨床康復;2005年29期

3 席靜;張成;盧錫林;謝有梅;李洵華;李寶琴;黃慧;;家族性ALS的臨床特征及基因分析[J];中風與神經疾病雜志;2006年01期

4 史樹貴,李露斯,陳康寧,劉昕;一個肌萎縮側索硬化家系的SOD1基因突變[J];中華醫(yī)學遺傳學雜志;2004年02期

5 吳成斯;邵蓓;徐仁O5;;肌萎縮側索硬化一家系的臨床特征及SOD1基因分析[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2009年05期

6 盧錫林;姚曉黎;張成;李洵樺;;肌萎縮側索硬化癥SOD1基因突變特點[J];中山大學學報(醫(yī)學科學版);2006年01期

7 陰均濤;張紅麗;閆欣;王亞飛;劉亞玲;;不同行為學測試方法在家族性肌萎縮側索硬化小鼠模型的比較[J];中國實驗動物學報;2013年01期

  本文關鍵詞：一種新的人突變SOD1轉基因小鼠模型的建立和臨床表型研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：383332