本文關鍵詞：pre-B細胞中CTCF介導沉默子Sis和增強子Ei相互作用并抑制VJ重排，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：真核細胞基因表達的精確調控需要順勢調控元件之間以及順式調控元件和啟動子之間發(fā)生直接的相互作用,這種相互作用使得基因在特定的狀態(tài)下呈現(xiàn)特定的染色質高級結構。小鼠免疫球蛋白輕鏈kappa(Igκ)基因是研究細胞分化過程中染色質高級結構變化的理想模型。Igκ基因包含95個功能VK基因,4個功能JK基因,以及一個CK基因。目前已發(fā)現(xiàn)的Igκ因順式調控元件包括沉默子Sis,位于內含子區(qū)域的增強子(Ei),3’增強子(E3’)和下游增強子(Ed)。前B細胞(pre-B細胞)中,VK基因帶著自身啟動子半隨機地重排到任意的JK區(qū)域,并起始轉錄。Sis和Ei具有調節(jié)VJ重排的功能,Sis通過將Igκ基因定位到異染色質抑制VJ重排,而Ei通過促進"germline transcription"促進VJ重排。 CCCTC位點結合蛋白CTCF具有高度保守的鋅指結構,并在基因表達調控中有重要作用,如調控基因活化和沉默,參與基因印記等。此外CTCF還能介導形成染色質內部及染色質之間的相互作用。有報道推測在pre-B細胞中CTCF結合在Sis上,然而CTCF是否介導Igκ基因的染色質高級結構,是否調控VJ的重排依然不是很清楚。 通過染色質構象捕獲技術(3C)我們發(fā)現(xiàn)在pre-B細胞中Sis與Ei之間發(fā)生直接的相互作用,Igκ因形成一個染色質環(huán),而在pro-B細胞中則不存在這種直接的相互作用。通過shRNA下調CTCF的表達,我們發(fā)現(xiàn)Ei-Sis之間的相互作用消失,同時"germline transcription"增強,VJ重排增強。這些結果說明CTCF是介導Ei-Sis相互作用的關鍵蛋白,而增強子和沉默子之間的相互作用能夠抑制增強子的功能。因此,我們認為CTCF通過介導Sis與Ei之間的相互作用,抑制了"germline transcription"進而抑制vJ重排,參與等位基因互斥調控中的單等位基因沉默效應。
【關鍵詞】：染色質構象捕獲 轉錄因子 CTCF 沉默子Sis 增強子Ei VJ重排
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 縮略語表8-9
• 前言9-12
• 研究現(xiàn)狀、成果9-11
• 研究目的、方法11-12
• 1 對象和方法12-36
• 1.1 染色質構象捕獲技術對象和方法12-20
• 1.1.1 實驗材料12-15
• 1.1.2 實驗原理15-16
• 1.1.3 技術流程16-19
• 1.1.4 對照實驗的設立19-20
• 1.2 染色體免疫共沉淀技術對象和方法20-26
• 1.2.1 染色體免疫共沉淀技術實驗材料20-22
• 1.2.2 染色體免疫共沉淀技術實驗原理22-23
• 1.2.3 染色體免疫共沉淀（Chip)技術流程23-26
• 1.3 shRNA下調CTCF表達技術對象和方法26-32
• 1.3.1 ShRNA下調CTCF表達技術實驗材料26-29
• 1.3.2 shRNA質粒的構建29-31
• 1.3.3 iCTCF-shRNA慢病毒產(chǎn)生和70Z/3細胞的感染31-32
• 1.3.4 Western Blot檢測CTCF的基因沉默水平32
• 1.4 Igκ基因重排實驗對象和方法32-36
• 1.4.1 lgx互基因重排實驗材料32-34
• 1.4.2 細胞總RNA的提取及Real-time PCR檢測34-35
• 1.4.3 PCR檢測V_κ的重排35-36
• 2 結果36-43
• 2.1 Sis和Ei僅在pre-B細胞中存在相互作用36-39
• 2.1.1 3C對照實驗的設立36-37
• 2.1.2 pro-B細胞38B9中Sis和Ei不存在相互作用37-38
• 2.1.3 pre-B細胞70Z/3中Sis和Ei存在相互作用38-39
• 2.2 在70Z/3細胞中CTCF結合于Sis片段39
• 2.3 shRNA質粒的構建39-41
• 2.3.1 pSPR-iCTCF質粒的鑒定39-40
• 2.3.2 277-iCTCF質粒的鑒定40-41
• 2.4 70Z/3細胞中CTCF下調后Sis與Ei相互作用消失41-42
• 2.5 CTCF通過抑制Igκ基因germline的轉錄從而抑制VJ重排42-43
• 3 討論43-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-50
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明50-51
• 綜述51-63
• 綜述參考文獻58-63
• 致謝63

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：pre-B細胞中CTCF介導沉默子Sis和增強子Ei相互作用并抑制VJ重排，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：382900