發(fā)布時(shí)間：2017-05-20 20:18

  本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞與汗腺細(xì)胞融合實(shí)現(xiàn)汗腺再生的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stemcells，hUC-MSCs）及人汗腺細(xì)胞（human sweat gland cells, h-SGCs）分離培養(yǎng)，找出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外合適培養(yǎng)環(huán)境，，探討利用細(xì)胞融合技術(shù)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人汗腺細(xì)胞在聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）的作用下誘導(dǎo)融合，研究合核細(xì)胞的生物學(xué)特性，為汗腺再生探索一條新的方法和途徑。 方法： 1UC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：獲取無菌足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶，剔除血管（兩條動(dòng)脈、一條靜脈）并用鑷子取出臍帶中的沃頓膠組織(Wharton’s Jelly)剪成大小約1mm3的組織塊。將組織塊按適當(dāng)密度接種于培養(yǎng)板中，當(dāng)鏡下觀察到組織塊周圍有呈集落生長的成纖維狀細(xì)胞時(shí)，去除組織塊，添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度時(shí)適時(shí)傳代，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化，按104/cm2傳代培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況。 2UC-MSCs的標(biāo)記：將第二代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞消化后制單細(xì)胞懸液，離心，取細(xì)胞沉淀，用稀釋液C重懸細(xì)胞,迅速加入到PKH26工作液（PKH26染料250倍稀釋）中染色1-5min，血清終止反應(yīng)，DMEM/F12完全培養(yǎng)基洗滌2次后正常培養(yǎng)(具體操作步驟按說明書進(jìn)行)。在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記結(jié)果。倒置相差顯微鏡下觀察標(biāo)記后細(xì)胞形態(tài)。 3UC-MSCs生長的影響因素及生長曲線的繪制：用MTT比色法分別檢測(cè)不同濃度的胎牛血清在490nm處，吸光度值的均數(shù)(OD值)。同樣用MTT比色法分別檢測(cè)干細(xì)胞不同種植密度在490nm處，吸光度值的均數(shù)(OD值)。觀察傳代后不同時(shí)期干細(xì)胞的生長情況并繪制生長曲線。 4汗腺細(xì)胞(h-SGCs)的培養(yǎng)：取正常全層頭部皮膚去除皮下脂肪后，剪成1mm3大小組織塊，用Ⅱ型膠原酶消化法獲得汗腺組織，汗腺培養(yǎng)基培養(yǎng)，大部分汗腺團(tuán)塊汗腺細(xì)胞(h-SGCs)貼壁爬出后，進(jìn)行換液，已后3-4天換液一次。對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，看CEA和CK19表面抗原的表達(dá)情況。 5汗腺細(xì)胞的標(biāo)記：將第一代汗腺細(xì)胞消化后制單細(xì)胞懸液，離心，取細(xì)胞沉淀，加入CFDASE細(xì)胞標(biāo)記液和CFDASE儲(chǔ)存液（2X）進(jìn)行標(biāo)記，完全培養(yǎng)液（含血清）終止標(biāo)記，洗滌三次后正常培養(yǎng)(具體操作步驟按說明書進(jìn)行)。在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記效果。 6間充質(zhì)干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞的融合、篩選及干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合體的鑒定：融合方法：分別取對(duì)數(shù)生長期已標(biāo)記的P3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和已標(biāo)記的P0代汗腺細(xì)胞，用5ml GENMED清理液(reagentA)清洗，離心，去上清后用GENMED清理液(reagentA)洗滌，取細(xì)胞沉淀加入GENMED融合液（reagent B）進(jìn)行融合，用GENMED清理液(reagentA)洗滌終止反應(yīng)，去上清后正常培養(yǎng)。篩選方法：將標(biāo)記后的融合細(xì)胞稀釋置于96孔板，用熒光顯微鏡觀察，標(biāo)記出紅色熒光和綠色熒光均顯示的孔，將標(biāo)記孔內(nèi)的細(xì)胞匯入到一個(gè)孔內(nèi)培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況及時(shí)檢測(cè)并擴(kuò)大培養(yǎng)。鑒定方法：將培養(yǎng)的融合細(xì)胞分別進(jìn)行免疫組化法檢測(cè)CEA和CK19表面抗原的表達(dá)情況和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)率。同時(shí)以汗腺培養(yǎng)基培養(yǎng)的UC-MSCs作為對(duì)照，檢測(cè)CEA和CK19陽性細(xì)胞的比例。 結(jié)果： 1UC-MSCs分離、培養(yǎng)、鑒定：培養(yǎng)5-7d后,已有少量臍帶組織塊爬出成纖維樣細(xì)胞。二周后，可見部分組織塊爬出成纖維樣細(xì)胞，給予換液。之后2-3天給予換液一次，傳1、2代(P1、P2)的UC-MSCs呈長梭行，形態(tài)均一。培養(yǎng)至九代(P9)的UC-MSCs，細(xì)胞生長緩慢，形態(tài)開始發(fā)生變化，折光性變得較差，培養(yǎng)至十二代的(P12)UC-MSCs部分細(xì)胞開始脫壁凋亡。對(duì)分離培養(yǎng)的UC-MSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD105、 CD29表達(dá)率較高，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達(dá)，提示本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)得到的細(xì)胞為較純化的UC-MSCs。 2經(jīng)熒光顯微鏡下觀察經(jīng)PKH26染料標(biāo)記的干細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，通過計(jì)算標(biāo)記率達(dá)到98%。倒置相差顯微鏡下觀察，標(biāo)記后細(xì)胞形態(tài)仍然成長梭形。 3UC-MSCs生長的影響因素及生長曲線的繪制：當(dāng)胎牛血清濃度為10%時(shí)MTT比色法檢測(cè)的OD490值最高，細(xì)胞活性好，活細(xì)胞數(shù)量多。當(dāng)種植密度為105/ml時(shí)MTT比色法檢測(cè)的OD490值最高，細(xì)胞活性好，活細(xì)胞數(shù)量多。從繪制的細(xì)胞生長曲線來看，接種后的UC-MSCs生長狀況包含三期，滯留期、生長對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期。 4汗腺細(xì)胞(h-SGCs)的培養(yǎng)：培養(yǎng)7天后，已有汗腺貼壁，鏡下可見少量汗腺團(tuán)塊周圍爬出不規(guī)則形細(xì)胞，呈集落狀生長；10天后，鏡下可見汗腺團(tuán)塊周圍爬滿不規(guī)則細(xì)胞，呈鋪路石樣生長。 5經(jīng)熒光顯微鏡下觀察經(jīng)CFDA SE細(xì)胞標(biāo)記液標(biāo)記的汗腺細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，通過計(jì)算標(biāo)記率達(dá)到99%。 6干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合細(xì)胞鑒定：將干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測(cè)細(xì)胞特異抗原，CEA和CK19包漿染色為棕色，為陽性。將干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)率較高，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達(dá)。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)通過研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離后，在不同條件下培養(yǎng)、誘導(dǎo)及鑒定，得出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件。并進(jìn)一步通過細(xì)胞融合技術(shù)獲得干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合細(xì)胞，檢測(cè)融合細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)率和表面抗原的表達(dá)情況，得到以下結(jié)論： 1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)率較高，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達(dá)，提示本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)得到的細(xì)胞較純，可以用于實(shí)驗(yàn)研究。 2PKH26染料可以作為活體示蹤染料，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光，染色較均勻，且不影響細(xì)胞的正常傳代。 3在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)UC-MSCs最適宜的生長環(huán)境為：培養(yǎng)液中胎牛血清和DMEM(L)培養(yǎng)基的配比是1:9，最適宜的種植密度是105/ml。UC-MSCs生長曲線呈近似“S”型，從實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)P3以內(nèi)的UC-MSCs形態(tài)穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)、代謝旺盛。如果條件允許，最好使用三代內(nèi)的干細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。 4CFDA SE進(jìn)入細(xì)胞后分解成CFSE可以作為活體示蹤染料，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，染色較均勻，且不影響細(xì)胞的正常傳代。 5經(jīng)鑒定誘導(dǎo)融合后的干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融細(xì)胞，免疫組化檢測(cè)CEA和CK19表面抗原均為陽性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)率較高，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達(dá)。提示誘導(dǎo)融合后的干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合體同時(shí)具備部分干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞的生物學(xué)特性。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs) 人汗腺細(xì)胞(h-SGCs) 融合細(xì)胞 聚乙二醇化學(xué)融合法 熒光顯微鏡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13
• 材料與方法13-22
• 結(jié)果22-24
• 附圖24-33
• 附表33-34
• 討論34-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 綜述 細(xì)胞融合技術(shù)實(shí)現(xiàn)汗腺再生的研究現(xiàn)狀40-47
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 致謝47-48
• 個(gè)人簡歷48

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫麗;于麗;張華芳;江洪;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2011年02期

2 季鳳清;王屹;孫海梅;王丹妮;曾曉蓓;趙春禮;楊慧;;人臍血非造血干細(xì)胞免疫原性的實(shí)驗(yàn)研究[J];解剖學(xué)報(bào);2008年01期

3 卞倩,仇鎮(zhèn)寧,管曉虹,王心如;人卵泡刺激素β亞基單克隆抗體的制備及鑒定[J];免疫學(xué)雜志;2004年01期

4 郝白露;楊瑞峰;彭祥熾;趙凱;李紅鋼;胡廉;熊承良;;改良的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法[J];中國計(jì)劃生育學(xué)雜志;2013年01期

5 孫建華;丁鐫;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性與研究進(jìn)展[J];臨床輸血與檢驗(yàn);2013年02期

6 吳畏;徐海偉;屈婭;陰正勤;;細(xì)胞融合致體細(xì)胞重編程機(jī)制研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年04期

7 趙志強(qiáng);鄭小林;張思杰;韋曉蘭;;細(xì)胞融合技術(shù)[J];生物學(xué)通報(bào);2005年10期

8 劉仰斌;周建榮;張志花;徐燕;;體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞源性表皮干細(xì)胞向汗腺上皮細(xì)胞分化的研究[J];山東醫(yī)藥;2012年39期

9 許丹;潘增祥;蔣曉明;蔡令波;張艷麗;丁曉麟;王鋒;;干細(xì)胞參與組織再生的一種機(jī)制:細(xì)胞融合[J];生命科學(xué);2006年04期

10 溫建明;;細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用[J];韶關(guān)大學(xué)韶關(guān)師專學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1991年01期

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本文編號(hào)：382728