本文關(guān)鍵詞：人乳頭瘤病毒（HPV）衣殼蛋白L1五聚體形成的體外可控自組裝，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人乳頭瘤病毒（HPV）是無包膜雙鏈DNA病毒，其衣殼由晚期表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白L1和L2組成。在適當(dāng)?shù)臈l件下，L1蛋白能形成五聚體（Pentamer），并由72個五聚體自組裝（self-assembly）成類病毒顆粒（Virus-like Particles,VLPs）。利用真核細(xì)胞、酵母或大腸桿菌均可有效表達(dá)HPV L1，且在沒有L2參與下L1蛋白自身也可以在體外自組裝成VLPs。由于婦女宮頸癌的發(fā)生直接與HPV的感染和復(fù)制有關(guān)，目前化學(xué)家和生物學(xué)家正在試圖從多角度去了解、認(rèn)識和模擬HPV病毒的繁衍機制，希望能從根本上揭示這一病毒的生命活動規(guī)律，達(dá)到有效預(yù)防或制服它的目的。利用目前的方法所表達(dá)出的L1均是以五聚體或VLPs的形式存在，因此還沒有人拿到過具有完整結(jié)構(gòu)的L1蛋白單體，對其由單體到五聚體的形成過程及調(diào)控因素更是知之甚少。基于此，我們提出了HPV L1五聚體自組裝的研究思路，，并在體外實施由單體到五聚體、再到VLPs的多級、可控自組裝。 通過研究我們發(fā)現(xiàn)GST融合表達(dá)的L1蛋白（GST-L1）能正確折疊，但由于N-末端GST的位阻效應(yīng)迫使它只能以單體形式存在；除去GST標(biāo)簽后的L1仍然能自組裝成五聚體。在此我們利用穩(wěn)態(tài)光散射(SLS)技術(shù)首次實現(xiàn)對HPV L1蛋白由單體到五聚體的形成過程的原位監(jiān)控，也為其它抗病毒制劑調(diào)控五聚體的形成提供了一條新的監(jiān)測途徑。 基于上述發(fā)現(xiàn)，我們引進(jìn)了有機小分子抑制劑對五聚體形成機制進(jìn)一步研究。通過實驗發(fā)現(xiàn)柱芳烴（pillarene）和杯芳烴(calixarene)不僅對HPV L1上的賴氨酸和精氨酸具有很好的選擇性，而且對抑制五聚體形成具有很明顯的效果。接下來我們還對柱芳烴和杯芳烴的抑制效率做了進(jìn)一步比較，發(fā)現(xiàn)柱芳烴可以更有效的抑制五聚體的形成，而且兩者與HPV L1結(jié)合能力以及分子作用機制也有所不同。 緊接著我們精心設(shè)計了三種不同的蛋白純化方案，發(fā)現(xiàn)共純化的伴侶蛋白GroEL能幫助L1蛋白進(jìn)行正確折疊，從而促進(jìn)五聚體形成，并最終提高類病毒顆粒（VLPs）的產(chǎn)量。這一發(fā)現(xiàn)揭示了伴侶蛋白對HPV L1五聚體形成的作用機制，并對未來疫苗的發(fā)展提供了獨特的生物技術(shù)支持。
【關(guān)鍵詞】：人乳頭瘤病毒 自組裝 單體 五聚體 抑制劑 伴侶蛋白
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373
【目錄】：

• 提要4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-21
• 1.1 人乳頭瘤病毒簡介12-15
• 1.2 人乳頭瘤病毒的自組裝與解組裝15-16
• 1.3 人乳頭瘤病毒衣殼蛋白與有機小分子的主客體相互作用16-18
• 1.4 伴侶蛋白簡介18-19
• 1.5 本文研究的設(shè)計思路19-21
• 第二章 體外監(jiān)控HPV16型主衣殼蛋白L1單體到五聚體的組裝過程21-32
• 2.1 引言21
• 2.2 實驗部分21-24
• 2.2.1 樣品和試劑21-22
• 2.2.2 實驗儀器22-23
• 2.2.3 實驗方法23-24
• 2.3 結(jié)果與討論24-30
• 2.3.1 快速蛋白液相色譜檢測25-26
• 2.3.2 L1 單體、五聚體的二級結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性分析26-27
• 2.3.3 蛋白顆粒粒徑檢測27
• 2.3.4 蛋白顆粒形貌表征27-28
• 2.3.5 五聚體形成的自組裝監(jiān)控28-30
• 2.4 本章小結(jié)30-32
• 第三章 有機小分子CP5A和SC4A有效抑制HPV 16L 1五聚體的形成32-49
• 3.1 引言32-33
• 3.2 實驗部分33-37
• 3.2.1 樣品和試劑33-34
• 3.2.2 實驗儀器34-35
• 3.2.3 實驗方法35-37
• 3.3 結(jié)果與討論37-48
• 3.3.1 利用 SLS 監(jiān)控 CP5A 抑制五聚體形成37-38
• 3.3.2 CP5A 和 SC4A 對氨基酸殘基的選擇性38-42
• 3.3.3 CP5A 對五聚體產(chǎn)量的影響42-44
• 3.3.4 CP5A 和 SC4A 抑制效果的比較44-47
• 3.3.5 晶體結(jié)構(gòu)分析47-48
• 3.4 本章小結(jié)48-49
• 第四章 伴侶蛋白GroEL在HPV L1 蛋白折疊與五聚體形成的過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用49-59
• 4.1 引言49
• 4.2 實驗部分49-52
• 4.2.1 樣品和試劑49-50
• 4.2.2 實驗儀器50-51
• 4.2.3 實驗方法51-52
• 4.3 結(jié)果與討論52-58
• 4.3.1 第一種純化方案52-55
• 4.3.2 第二種純化方案55-56
• 4.3.3 第三種純化方案56-57
• 4.3.4 伴侶蛋白對 L1 產(chǎn)量以及對五聚體形成效率的影響57-58
• 4.4 本章小結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-69
• 附錄69-73
• 作者簡介及已發(fā)表成果73-74
• 致謝74

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本文編號：381901