本文關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒PP65抗原ELISA檢測試劑的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的制備重組PP65多克隆抗體（pAb），研制檢測PP65抗原血癥的ELISA檢測試劑。 方法表達(dá)及純化重組PP65蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，Western Blot鑒定重組PP65蛋白的抗原性。重組PP65蛋白免疫新西蘭大耳白兔和SD大鼠，制備相應(yīng)pAb。間接ELISA測定pAb效價，飽和硫酸銨沉淀法純化pAb。玻片凝集實(shí)驗(yàn)分析pAb與是否與環(huán)境微生物發(fā)生交叉反應(yīng)。探索pAb和重組PP65相互結(jié)合的各自最佳濃度、最適包被抗體與檢測抗體的搭配方案，選擇適合的包被溫度、包被時間、封閉液以及底物顯色時間等，優(yōu)化檢測試劑的條件，建立試劑的檢測步驟及PP65抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定試劑精密度及檢出下限。通過對101份臨床疑似HCMV感染標(biāo)本的檢測，并與市售HCMV-IgM（ELISA）試劑以及HCMV-DNA（FQ-PCR）試劑的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，分析自制PP65抗原ELISA檢測試劑的敏感性與特異性。用自制試劑檢測單純皰疹病毒1型、2型以及EB病毒感染血標(biāo)本，分析自制試劑是否非特異結(jié)合皰疹病毒科其他病毒抗原。檢測并分析比較PP65抗原在單個核細(xì)胞與多形核細(xì)胞中的表達(dá)情況。 結(jié)果純化得到重組PP65蛋白，蛋白濃度為0.21mg/ml。經(jīng)Western Blot鑒定，該蛋白可與PP65單克隆抗體特異性結(jié)合。免疫所得兔血清pAb效價達(dá)1:400000，大鼠血清pAb效價1:20000。玻片凝集實(shí)驗(yàn)提示制備的兩種pAb均不與環(huán)境空氣中細(xì)菌以及常見葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌反應(yīng)，說明pAb特異性較高。檢測試劑的條件優(yōu)化，確定了1:2000大鼠pAb為包被抗體，，1:20000兔pAb為檢測抗體，2%的BSA為封閉液，4℃包被12h，底物顯色15min等檢測條件，建立了檢測PP65抗原血癥的ELISA方法和PP65抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線。研制所得HCMV PP65抗原ELISA檢測試劑的檢出下限為5ng/ml，批內(nèi)精密度與批間精密度均小于10%。自制試劑與市售HCMV-IgM（ELISA）試劑相比檢測結(jié)果有差別（P0.05），與市售HCMV-DNA（FQ-PCR）試劑相比，檢測結(jié)果無差別（P0.05），相對于HCMV-DNA（FQ-PCR）試劑的一致率為97.0%。自制試劑對單純皰疹病毒1型、2型以及EB病毒感染血標(biāo)本的檢測結(jié)果均為陰性，排除了試劑非特異結(jié)合皰疹病毒科其他病毒抗原的可能。經(jīng)分析PP65抗原在單個核細(xì)胞與多形核細(xì)胞中的表達(dá)量無顯著性差異（P0.05），提示自制試劑的檢測標(biāo)本取外周白細(xì)胞抗原即可。 結(jié)論建立了檢測HCMV PP65抗原的間接雙抗夾心ELISA方法，試劑具有較好的敏感性、特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。
【關(guān)鍵詞】：人巨細(xì)胞病毒 PP65抗原 pAb ELISA
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-9
• 前言9-11
• 第一部分 人巨細(xì)胞病毒 PP65_322-561蛋白的原核表達(dá)及鑒定11-20
• 材料11-14
• 方法14-17
• 結(jié)果17-20
• 第二部分 PP65多克隆抗體的制備及PP65 抗原ELISA檢測試劑的研制20-32
• 材料20-21
• 方法21-25
• 結(jié)果25-32
• 第三部分 HCMV PP65 抗原 ELISA 檢測試劑的應(yīng)用32-36
• 材料32
• 方法32-34
• 結(jié)果34-36
• 討論36-38
• 結(jié)論38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 綜述41-50
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 致謝50-51
• 個人簡歷51

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒PP65抗原ELISA檢測試劑的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：381715