發(fā)布時間：2017-05-20 10:13

  本文關鍵詞：NY-ESO-1的原核表達、抗體制備及其鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：構建腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1與GST融合基因的原核表達載體,制備其單克隆抗體及多克隆抗體并進行初步鑒定,通過Westen-blot檢測其特異性,利用免疫組化研究其在腫瘤治療上的應用價值。方法：1目的基因的獲得及重組表達載體的構建設計針對NY-ESO-1的特異性引物,采用聚合酶鏈反應(PCR)從睪丸組織的cDNA文庫擴增NY-ESO-1基因片段,經(jīng)上下游引物所引入的EcoR I和Xho I雙酶切后克隆入原核表達載體pGEX-4T1中GST標簽的下游,構建重組表達載體pGEX-4T1-NY-ESO-1。2細菌培養(yǎng)將載體pGEX-4T1-NY-ESO-1轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中,進行細菌培養(yǎng)。3目的蛋白的誘導表達、純化及鑒定用IPTG誘導表達NY-ESO-1/GST融合蛋白,經(jīng)不同濃度尿素洗脫純化后,表達產(chǎn)物通過SDS-PAGE和Western blot法鑒定獲得NY-ESO-1/GST融合蛋白。4單克隆抗體制備用NY-ESO-1/GST融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用傳統(tǒng)方法制備抗NY-ESO-1單克隆抗體,通過細胞融合,HAT選擇,有限稀釋法克隆擴增,獲得NY-ESO-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株。5多克隆抗體制備將NY-ESO-1/GST融合蛋白免疫家兔制備NY-ESO-1多抗血清,獲得NY-ESO-1多克隆抗體。6抗體的鑒定及免疫組化通過間接ELISA法測定抗體效價,Western-blot檢測其的特異性。利用免疫組化技術研究其在正常睪丸組織和癌組織檢測中的應用價值。結果：重組質粒經(jīng)限制性內切酶EcoR I和Xho I雙酶切鑒定和IPTG誘導表達NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明,表達產(chǎn)物的相對分子質量(Mr)為44000,與理論值相符,并主要以包涵體形式存在,Western blot結果證實該NY-ESO-1/GST可與抗GST單克隆抗體(mAb)發(fā)生特異性結合反應,提示為融合蛋白。通過單克隆抗體的制備,免疫獲得了1株抗NY-ESO-1單克隆抗體細胞株,經(jīng)過間接EL1SA檢測,抗體效價為10-7,經(jīng)Westem blot和免疫組化等鑒定,抗體的特異性良好,與載體蛋白GST無交叉反應。免疫家兔后獲得高效價NY-ESO-1抗血清,Westem blot檢測證實該血清特異性較好。通過免疫組化技術檢測結果顯示可見其目的基因在正常睪丸組織和癌組織中均有表達。結論：成功構建了NY-ESO-1基因原核表達載體pGEX-4T1-NY-ESO-1,利用大腸桿菌表達系統(tǒng),獲得了較高純度的包涵體形式NY-ESO-1/GST融合蛋白,成功建立了1株抗NY-ESO-1單克隆抗體細胞株,由于Westem blot鑒定結果良好,同時成功制備兔抗人NY-ESO-1多克隆抗體,通過檢測,結果良好,為NY-ESO-1生物學功能研究奠定了基礎。
【關鍵詞】：NY-ESO-1 融合蛋白 原核表達 單克隆抗體 多克隆抗體 Westem blot 免疫組化
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 英文縮寫9-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-26
• 結果26-30
• 附圖30-36
• 附表36-39
• 討論39-40
• 結論40-41
• 參考文獻41-43
• 綜述 腫瘤/睪丸抗原NY-ESO-1的研究進展43-52
• 參考文獻48-52
• 致謝52-53
• 個人簡歷53

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 梁爽;王曉華;趙艷明;楊華;;直腸癌中腫瘤/睪丸抗原相關基因的表達[J];中國實驗診斷學;2011年01期

  本文關鍵詞：NY-ESO-1的原核表達、抗體制備及其鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：381333