本文關(guān)鍵詞：NY-ESO-1的原核表達(dá)、抗體制備及其鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：構(gòu)建腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1與GST融合基因的原核表達(dá)載體,制備其單克隆抗體及多克隆抗體并進(jìn)行初步鑒定,通過(guò)Westen-blot檢測(cè)其特異性,利用免疫組化研究其在腫瘤治療上的應(yīng)用價(jià)值。方法：1目的基因的獲得及重組表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)針對(duì)NY-ESO-1的特異性引物,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從睪丸組織的cDNA文庫(kù)擴(kuò)增NY-ESO-1基因片段,經(jīng)上下游引物所引入的EcoR I和Xho I雙酶切后克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T1中GST標(biāo)簽的下游,構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-4T1-NY-ESO-1。2細(xì)菌培養(yǎng)將載體pGEX-4T1-NY-ESO-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中,進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。3目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)NY-ESO-1/GST融合蛋白,經(jīng)不同濃度尿素洗脫純化后,表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE和Western blot法鑒定獲得NY-ESO-1/GST融合蛋白。4單克隆抗體制備用NY-ESO-1/GST融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用傳統(tǒng)方法制備抗NY-ESO-1單克隆抗體,通過(guò)細(xì)胞融合,HAT選擇,有限稀釋法克隆擴(kuò)增,獲得NY-ESO-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。5多克隆抗體制備將NY-ESO-1/GST融合蛋白免疫家兔制備NY-ESO-1多抗血清,獲得NY-ESO-1多克隆抗體。6抗體的鑒定及免疫組化通過(guò)間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià),Western-blot檢測(cè)其的特異性。利用免疫組化技術(shù)研究其在正常睪丸組織和癌組織檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果：重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I雙酶切鑒定和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明,表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為44000,與理論值相符,并主要以包涵體形式存在,Western blot結(jié)果證實(shí)該NY-ESO-1/GST可與抗GST單克隆抗體(mAb)發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),提示為融合蛋白。通過(guò)單克隆抗體的制備,免疫獲得了1株抗NY-ESO-1單克隆抗體細(xì)胞株,經(jīng)過(guò)間接EL1SA檢測(cè),抗體效價(jià)為10-7,經(jīng)Westem blot和免疫組化等鑒定,抗體的特異性良好,與載體蛋白GST無(wú)交叉反應(yīng)。免疫家兔后獲得高效價(jià)NY-ESO-1抗血清,Westem blot檢測(cè)證實(shí)該血清特異性較好。通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示可見(jiàn)其目的基因在正常睪丸組織和癌組織中均有表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建了NY-ESO-1基因原核表達(dá)載體pGEX-4T1-NY-ESO-1,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),獲得了較高純度的包涵體形式NY-ESO-1/GST融合蛋白,成功建立了1株抗NY-ESO-1單克隆抗體細(xì)胞株,由于Westem blot鑒定結(jié)果良好,同時(shí)成功制備兔抗人NY-ESO-1多克隆抗體,通過(guò)檢測(cè),結(jié)果良好,為NY-ESO-1生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：NY-ESO-1 融合蛋白 原核表達(dá) 單克隆抗體 多克隆抗體 Westem blot 免疫組化
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 英文縮寫(xiě)9-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-26
• 結(jié)果26-30
• 附圖30-36
• 附表36-39
• 討論39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 綜述 腫瘤/睪丸抗原NY-ESO-1的研究進(jìn)展43-52
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 致謝52-53
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷53

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 梁爽;王曉華;趙艷明;楊華;;直腸癌中腫瘤/睪丸抗原相關(guān)基因的表達(dá)[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2011年01期

  本文關(guān)鍵詞：NY-ESO-1的原核表達(dá)、抗體制備及其鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：381333