發(fā)布時(shí)間：2017-05-20 04:09

  本文關(guān)鍵詞：不同亞型重組人白細(xì)胞介素8蛋白表達(dá)、純化與活性檢測(cè)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：白細(xì)胞介素一8 (Interleukin-8, IL-8)是一種多功能性的細(xì)胞因子,屬于趨化因子CXC亞家族的一員,是體內(nèi)炎癥反應(yīng)應(yīng)答的主要介質(zhì)之一。除常規(guī)生化檢測(cè)方法之外,尚未有報(bào)道利用蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)檢測(cè)(Protein FragmentComplementation Assay, PCA)技術(shù)對(duì)IL-8的生物學(xué)活性進(jìn)行測(cè)定。本文利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)重組人源性IL-8的高效表達(dá)、純化,并利用PCA技術(shù)實(shí)現(xiàn)重組IL-8活性檢測(cè)。方法：將3種不同亞型的重組人IL-8基因片段分別與表達(dá)載體pME-15-6His和pET-32a連接,轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK 293F和大腸桿菌BL2l(DE3),進(jìn)行IL-8的表達(dá)。采用IMAC親和層析柱對(duì)重組人IL-8進(jìn)行純化。根據(jù)PCA技術(shù),構(gòu)建了Split-TEV GPCR激活檢測(cè)系統(tǒng),對(duì)純化的目的蛋白進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)。結(jié)果：成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pME-15-6His/IL-8formI,前體IL-8基因在HEK293F中正確分泌表達(dá),其N端信號(hào)肽(殘基1-20)被切除,經(jīng)過(guò)純化得到的重組蛋白為成熟的IL-8 form I(殘基21-99)；成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a/IL-8 formII和pET-32a/IL-8 form III,N端融合了Trx標(biāo)簽的重組蛋白在大腸桿菌中正確表達(dá),經(jīng)過(guò)純化和重組腸激酶酶切得到的重組蛋白為IL-8 form II(殘基23-99)和IL-8form III(殘基28-99)。純化后的重組人IL-8對(duì)其天然受體IL8RB具有明顯的激活活性,其ECso值分別為：12.32ng/ml (Form Ⅰ),15.14 ng/ml (Form Ⅱ)和2.85ng/ml (Form Ⅲ)。結(jié)論：成功構(gòu)建、表達(dá)和純化了具有生物學(xué)活性的3種不同亞型的重組人IL-8,為進(jìn)一步的理論研究和大批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：白細(xì)胞介素-8 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 活性檢測(cè) 蛋白質(zhì)片段互補(bǔ) Split-TEV
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 第一章 重組人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白表達(dá)和純化7-25
• 前言7
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器7-9
• 1.1.1 菌株與載體7-8
• 1.1.2 工具酶與試劑8
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備8-9
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法9-16
• 1.2.1 重組人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ表達(dá)載體構(gòu)建9-12
• 1.2.2 重組人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白表達(dá)12-14
• 1.2.3 重組人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白純化14-16
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論16-24
• 1.3.1 不同IL-8亞型的克隆及載體構(gòu)建16-17
• 1.3.2 HEK 293F細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)重組人IL-8 formⅠ蛋白17-18
• 1.3.3 大腸桿菌表達(dá)IL-8 FormⅠ和IL-8 FormⅡ重組蛋白18-20
• 1.3.4 重組人IL-8蛋白的純化20-24
• 1.4 結(jié)論24-25
• 第二章 重組人IL-8蛋白細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)25-37
• 前言25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器25-26
• 2.1.1 菌株、載體、基因模板25
• 2.1.2 工具酶與試劑25
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-29
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)26-27
• 2.2.2 真核表達(dá)載體構(gòu)建27-28
• 2.2.3 不同亞型的重組人IL-8蛋白活性測(cè)定28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論29-36
• 2.3.1 Split-TEV GPCR測(cè)活檢測(cè)系統(tǒng)原理29-31
• 2.3.2 Split-TEV GPCR測(cè)活檢測(cè)系統(tǒng)真核表達(dá)載體的構(gòu)建31-34
• 2.3.3 轉(zhuǎn)染與生物學(xué)活性檢測(cè)34-36
• 2.4 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 綜述39-49
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 致謝49-50

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1 幺山山,曾明,章金剛;幽門螺桿菌肽脫甲�；富虻谋磉_(dá)、純化與活性檢測(cè)[J];藥品評(píng)價(jià);2005年03期

2 王雙虎;戴大鵬;胡利明;耿培武;蔡劍平;胡國(guó)新;;細(xì)胞色素P450 2C9藥物代謝酶體外酶學(xué)活性檢測(cè)新方法的建立[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2013年02期

3 郝京生;人類紅細(xì)胞的NK增強(qiáng)因子的鑒定[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));1993年06期

4 王乾蘭;;促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性檢測(cè)方法比較[J];中國(guó)生化藥物雜志;2006年01期

5 馬晶;郭秀嬋;張曉光;張曉梅;曾毅;;HIV P66蛋白的表達(dá)、純化及活性檢測(cè)[J];病毒學(xué)報(bào);2006年05期

6 閻家麒;涂潔;劉若平;郭曉艷;;修飾SOD的活性檢測(cè)[J];中國(guó)生化藥物雜志;1993年02期

7 王國(guó)華,陳志陽(yáng),王曉鎖,蒲勤,藥立波;簡(jiǎn)化提取核心蛋白聚糖的方法及擴(kuò)大活性檢測(cè)范圍[J];中國(guó)生化藥物雜志;2001年04期

8 林琳;周存山;楊虎清;王允祥;;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶及其活性檢測(cè)研究進(jìn)展[J];食品工業(yè)科技;2009年12期

9 趙雪娜;武國(guó)棟;孫麗霞;黃山英;王慶民;薛彤彤;王晶翼;;腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的表達(dá)及其活性檢測(cè)[J];生物技術(shù);2011年04期

10 ;人類淋巴結(jié)自然殺傷(NK)細(xì)胞活性的探討[J];同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1988年04期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 鄭耘;楊善民;顏江華;陳瑞川;;MTT比法在細(xì)胞活性檢測(cè)中的影響因素[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

2 沈文正;靳亞平;李引乾;馬勇江;;孕兔子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞(EML)的制備及活性檢測(cè)[A];第四屆中國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2001年

3 金肆;陸德琴;葉仕橋;葉紅;朱莉萍;馮作化;胡清華;劉聲遠(yuǎn);王迪潯;;基于ELISA技術(shù)的轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)方法的改進(jìn)[A];中國(guó)科協(xié)第二十三屆新觀點(diǎn)新學(xué)說(shuō)學(xué)術(shù)沙龍論文集[C];2008年

4 陳寶玉;查云峰;劉勇軍;宋斯偉;宋德光;鄧旭明;;鼠防御素基因Crp4的表達(dá)及活性檢測(cè)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文與摘要集[C];2006年

5 付志浩;畢華;王軍志;饒春明;;PC-SOD活性測(cè)定方法的建立[A];2012年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十二屆中國(guó)藥師周論文集[C];2012年

6 陳亞寶;;SLE患者尿NAG活性檢測(cè)的臨床意義[A];2001年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

7 邱志輝;劉剛;鄭濤;陳惠鵬;;重組人pro-EMAPⅡ及其結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建表達(dá)與活性檢測(cè)[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨全國(guó)生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

8 馮運(yùn)鞏;李銀聚;程相朝;郁川;王學(xué)強(qiáng);張旭;張鵬;;Apo-tPA融合蛋白在雞胚肝細(xì)胞中的分泌表達(dá)及其活性檢測(cè)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)、中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病理生理專業(yè)委員會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

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1 Faisal Hamoud Ali Othman;[D];浙江大學(xué);2004年

2 潘延云;花粉PLC活性檢測(cè)、cDNA克隆及功能分析[D];河北師范大學(xué);2003年

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1 張列;番木瓜蛋氨酸亞砜還原酶B1基因克隆表達(dá)及其活性檢測(cè)[D];海南大學(xué);2015年

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4 黃躍才;幾種鐮刀菌的活性檢測(cè)研究[D];貴州大學(xué);2008年

5 田文洪;一種新的miRNA活性檢測(cè)方法研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2010年

6 江鵬;力生長(zhǎng)因子的原核表達(dá)及其活性檢測(cè)[D];重慶大學(xué);2007年

7 于銀霞;168號(hào)放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取和活性研究[D];首都師范大學(xué);2009年

8 蔣瑞瑞;雞Gal-11和Gal-12基因的克隆、表達(dá)及活性檢測(cè)[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

9 朱承丞;幾種S*PR網(wǎng)子類的活性條件及其應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2014年

10 姜少輝;mP24假定蛋白的CK2磷酸化活性測(cè)定[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：不同亞型重組人白細(xì)胞介素8蛋白表達(dá)、純化與活性檢測(cè)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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