本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲RH株ROP11基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及核酸疫苗免疫保護(hù)作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性有核細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能感染所有的恒溫動(dòng)物，據(jù)估計(jì)1/3的人口感染過弓形蟲。因其能導(dǎo)致視網(wǎng)膜瘢痕，腦損傷和孕婦流產(chǎn)后感染而成為引起人類疾病的一個(gè)主要原生物。弓形蟲棒狀體蛋白由其分泌器官棒狀體分泌，在蟲體入侵宿主細(xì)胞時(shí)具有重要的作用，尤其是與納蟲空泡的形成和修飾過程密切相關(guān)。本課題構(gòu)建了剛地弓形蟲RH株ROP11基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ROP11，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，間接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)情況；將重組質(zhì)粒肌肉注射免疫BALB/C小鼠，檢測(cè)小鼠血清IgG，，細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平并記錄弓形蟲感染小鼠后的存活時(shí)間評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)力，以期為進(jìn)一步研究弓形蟲ROP11基因核酸疫苗提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。 首先提取弓形蟲RH株速殖子總RNA，根據(jù)TgROP11基因全長編碼序列（登錄號(hào)為DQ077905）的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增，將擴(kuò)增的目的片段ROP11基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ROP11，之后將PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Not I酶切后與同樣經(jīng)EcoR I和Not I酶切的pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體連接，對(duì)重組質(zhì)粒做菌落PCR、EcoR I和Not I雙酶切和測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為1548bp，菌落PCR及雙酶切結(jié)果正確，序列測(cè)序結(jié)果與GenBank上報(bào)告的ROP11序列相比，8個(gè)核苷酸存在變異，導(dǎo)致5個(gè)氨基酸發(fā)生改變，其中在第56個(gè)氨基酸位置多了一個(gè)天冬酰胺。證明成功構(gòu)建了弓形蟲ROP11的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ROP11。 確定表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建后，將pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)大腸埃希菌（E.coli）XL-Blue內(nèi)，篩選陽性克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，之后通過Lipofector陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞內(nèi)。間接免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞胞漿觀察到黃綠色熒光，對(duì)照組無熒光，證明了構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒能夠在體外真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白。 最后堿裂解法大量提取質(zhì)粒，免疫小鼠。將40只8周齡BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒對(duì)照組、PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組均通過股四頭肌注射免疫小鼠，其中實(shí)驗(yàn)組注射pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒為100μg(1μg/μl)，空質(zhì)粒對(duì)照組注射pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為100μg(1μg/μl)，PBS對(duì)照組注射無菌PBS緩沖液為100μl，空白對(duì)照組不注射，共免疫3次，每次間隔2周，末次接種量均加倍。分別于每次注射前和末次注射后第二周取小鼠血清檢測(cè)抗體和細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10）。末次注射后2周各組小鼠腹腔攻擊感染RH株弓形蟲速殖子1×103個(gè)/只，觀察其存活時(shí)間及免疫保護(hù)力。小鼠免疫接種后，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗體IgG隨著免疫次數(shù)的增加而明顯增高，但空質(zhì)粒對(duì)照組、PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組相應(yīng)的血清中均未出現(xiàn)明顯升高，末次注射后實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG與空質(zhì)粒對(duì)照組、PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。實(shí)驗(yàn)組小鼠IFN-γ濃度均值為364.51pg/ml，較空質(zhì)粒對(duì)照組（49.55pg/ml）、PBS對(duì)照組（46.24pg/ml）、空白對(duì)照組（47.52pg/ml）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-2濃度均值為151.54pg/ml，較空質(zhì)粒對(duì)照組（49.40pg/ml）、PBS對(duì)照組（43.34pg/ml）、空白對(duì)照組（43.23pg/ml）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-4濃度均值為131.45pg/ml，較空質(zhì)粒對(duì)照組（50.28pg/ml）、PBS對(duì)照組（53.17pg/ml）、空白對(duì)照組（49.14pg/ml）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-10濃度均值為159.82pg/ml較空質(zhì)粒對(duì)照組（56.58pg/ml）、PBS對(duì)照組（52.18pg/ml）、空白對(duì)照組（49.29pg/ml）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組IgG抗體水平和細(xì)胞因子水平明顯升高，與空質(zhì)粒對(duì)照組、PBS對(duì)照組和空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。后經(jīng)抗感染免疫攻擊實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組、空質(zhì)粒組、PBS組和空白對(duì)照組小鼠平均存活時(shí)間為236.3h、97.8h、96.3h、96.2h，實(shí)驗(yàn)組與三對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠存活時(shí)間明顯延長（P0.05）。說明用pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后能增強(qiáng)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，為進(jìn)一步研究ROP11核酸疫苗的生物學(xué)功能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲 ROP11 真核表達(dá)質(zhì)粒 核酸疫苗 免疫反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R382.5;R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-28
• 結(jié)果28-31
• 附圖31-40
• 附表40-41
• 討論41-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述 弓形蟲基因疫苗的研究進(jìn)展49-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 江濤;陳芳;聶浩;方瑞;姚寶安;趙俊龍;;弓形蟲微線體蛋白MIC3基因的細(xì)胞免疫研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年18期

2 王妍;張守發(fā);金春梅;薛書江;;弓形蟲重組GRA3抗原單克隆抗體的制備與鑒定[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年12期

3 李博;魏峰;劉全;馬洪霞;許越;金洪濤;商立民;;弓形蟲ROP18基因重組蜥蜴利什曼原蟲的構(gòu)建及鑒定[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年02期

4 鄧小玲;DNA疫苗的作用機(jī)理以及抗腫瘤的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2005年01期

5 金春梅;張厚雙;薛書江;權(quán)根花;崔金偉;王興貴;;弓形蟲AMA1蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及免疫活性檢測(cè)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年29期

6 其木格;陳健;賈立軍;李月梅;金超;張守發(fā);;弓形蟲ROP4基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2010年01期

7 袁仕善;孫文霞;陳婧;唐小異;鄢慧;;重組弓形蟲致密顆粒蛋白7的表達(dá)及免疫活性分析[J];湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年01期

8 馬亮;刁玉梅;任保彥;宮鵬濤;李建華;張西臣;;弓形蟲RH株表面抗原SAG3去信號(hào)肽基因的蛋白原核表達(dá)及鑒定[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年01期

9 喬軍;楊松濤;夏咸柱;馮娜;戈銳;;弓形蟲虎源分離株ROP10基因的克隆、序列分析及其表達(dá)研究[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);2008年02期

10 魏慶寬;肖婷;崔勇;胡穎新;史世俊;李桂玲;傅婷霞;李瑾;黃炳成;韓廣東;;弓形蟲棒狀體蛋白的免疫原性及其DNA疫苗的研制[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2009年01期

  本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲RH株ROP11基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及核酸疫苗免疫保護(hù)作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：379590