發(fā)布時間：2017-05-19 19:15

  本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲RH株ROP11基因真核表達載體的構(gòu)建及核酸疫苗免疫保護作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性有核細胞內(nèi)寄生原蟲，能感染所有的恒溫動物，據(jù)估計1/3的人口感染過弓形蟲。因其能導(dǎo)致視網(wǎng)膜瘢痕，腦損傷和孕婦流產(chǎn)后感染而成為引起人類疾病的一個主要原生物。弓形蟲棒狀體蛋白由其分泌器官棒狀體分泌，在蟲體入侵宿主細胞時具有重要的作用，尤其是與納蟲空泡的形成和修飾過程密切相關(guān)。本課題構(gòu)建了剛地弓形蟲RH株ROP11基因的真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ROP11，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞，間接免疫熒光法檢測細胞內(nèi)蛋白表達情況；將重組質(zhì)粒肌肉注射免疫BALB/C小鼠，檢測小鼠血清IgG，，細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平并記錄弓形蟲感染小鼠后的存活時間評價其免疫保護力，以期為進一步研究弓形蟲ROP11基因核酸疫苗提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。 首先提取弓形蟲RH株速殖子總RNA，根據(jù)TgROP11基因全長編碼序列（登錄號為DQ077905）的開放閱讀框設(shè)計引物并進行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴增，將擴增的目的片段ROP11基因克隆至真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ROP11，之后將PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Not I酶切后與同樣經(jīng)EcoR I和Not I酶切的pcDNA3.1(+)真核表達載體連接，對重組質(zhì)粒做菌落PCR、EcoR I和Not I雙酶切和測序鑒定。結(jié)果顯示，RT-PCR擴增產(chǎn)物約為1548bp，菌落PCR及雙酶切結(jié)果正確，序列測序結(jié)果與GenBank上報告的ROP11序列相比，8個核苷酸存在變異，導(dǎo)致5個氨基酸發(fā)生改變，其中在第56個氨基酸位置多了一個天冬酰胺。證明成功構(gòu)建了弓形蟲ROP11的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ROP11。 確定表達質(zhì)粒成功構(gòu)建后，將pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)大腸埃希菌（E.coli）XL-Blue內(nèi)，篩選陽性克隆后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，之后通過Lipofector陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細胞內(nèi)。間接免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細胞胞漿觀察到黃綠色熒光，對照組無熒光，證明了構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒能夠在體外真核細胞內(nèi)表達目的蛋白。 最后堿裂解法大量提取質(zhì)粒，免疫小鼠。將40只8周齡BALB/C小鼠隨機分為4組，每組10只：實驗組、空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組，每組均通過股四頭肌注射免疫小鼠，其中實驗組注射pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒為100μg(1μg/μl)，空質(zhì)粒對照組注射pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為100μg(1μg/μl)，PBS對照組注射無菌PBS緩沖液為100μl，空白對照組不注射，共免疫3次，每次間隔2周，末次接種量均加倍。分別于每次注射前和末次注射后第二周取小鼠血清檢測抗體和細胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10）。末次注射后2周各組小鼠腹腔攻擊感染RH株弓形蟲速殖子1×103個/只，觀察其存活時間及免疫保護力。小鼠免疫接種后，實驗組小鼠血清抗體IgG隨著免疫次數(shù)的增加而明顯增高，但空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組相應(yīng)的血清中均未出現(xiàn)明顯升高，末次注射后實驗組小鼠血清IgG與空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。實驗組小鼠IFN-γ濃度均值為364.51pg/ml，較空質(zhì)粒對照組（49.55pg/ml）、PBS對照組（46.24pg/ml）、空白對照組（47.52pg/ml）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；實驗組小鼠IL-2濃度均值為151.54pg/ml，較空質(zhì)粒對照組（49.40pg/ml）、PBS對照組（43.34pg/ml）、空白對照組（43.23pg/ml）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；實驗組小鼠IL-4濃度均值為131.45pg/ml，較空質(zhì)粒對照組（50.28pg/ml）、PBS對照組（53.17pg/ml）、空白對照組（49.14pg/ml）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；實驗組小鼠IL-10濃度均值為159.82pg/ml較空質(zhì)粒對照組（56.58pg/ml）、PBS對照組（52.18pg/ml）、空白對照組（49.29pg/ml）比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。結(jié)果顯示，實驗組IgG抗體水平和細胞因子水平明顯升高，與空質(zhì)粒對照組、PBS對照組和空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。后經(jīng)抗感染免疫攻擊實驗發(fā)現(xiàn)實驗組、空質(zhì)粒組、PBS組和空白對照組小鼠平均存活時間為236.3h、97.8h、96.3h、96.2h，實驗組與三對照組比較，實驗組小鼠存活時間明顯延長（P0.05）。說明用pcDNA3.1(+)-ROP11重組質(zhì)粒對小鼠進行免疫后能增強小鼠的體液免疫和細胞免疫功能，為進一步研究ROP11核酸疫苗的生物學(xué)功能提供了實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲 ROP11 真核表達質(zhì)粒 核酸疫苗 免疫反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R382.5;R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-28
• 結(jié)果28-31
• 附圖31-40
• 附表40-41
• 討論41-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-49
• 綜述 弓形蟲基因疫苗的研究進展49-61
• 參考文獻56-61
• 致謝61-62
• 個人簡歷62

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲RH株ROP11基因真核表達載體的構(gòu)建及核酸疫苗免疫保護作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：379590