本文關鍵詞：靶向HCV包膜蛋白的信標適體應用于病毒檢測的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙型肝炎病毒（HCV）感染了全球大約3%（約1.7億）的人口，是肝臟疾病的主要病原體之一，可導致急性或慢性感染，慢性丙型肝炎可發(fā)展成肝硬化或肝癌，丙型肝炎每年新發(fā)病例約3.5萬例。HCV以血液傳播為主，發(fā)病隱匿，且癥狀不典型，患者容易因未能及時診斷而錯過治療的最佳時機。目前尚未開發(fā)出有效的HCV疫苗，現有的HCV臨床檢測存在窗口期較長，容易出現漏診或假陽性檢測結果，難以滿足大通量檢測和血液快速篩查的要求。因此，改善和發(fā)展HCV早期檢測的新方法迫在眉睫。 HCV包膜蛋白E1、E2是HCV病毒顆粒的結構蛋白，它們以非共價鍵形成異二聚體E1E2，主要參與細胞受體相互作用，誘導機體產生中和抗體，在病毒的感染和病毒顆粒的形成過程起關鍵作用，對HCV包膜蛋白的研究是熱點之一。 本論文成功擴增出HCV E1E2，并將目的基因插入到pET28b載體中，進行誘導表達和純化，得到大量E1E2蛋白。本論文首次以HCV包膜蛋白E1E2為靶分子，經指數富集配體系統進化技術（SELEX）篩選出特異性結合的核酸適體—Aptamer。進一步進行體外原核表達HCV E1、HCV E2蛋白，運用ELONA法（酶聯寡核苷酸檢測法）對篩選出來的Aptamer的特異性從反面進行了鑒定，結果發(fā)現篩選出的Aptamer能特異性地識別E1E2蛋白和E2蛋白，而不識別E1蛋白。將篩選得到的Aptamer修飾成分子信標核酸適體(molecular beacon aptamer，，MBA)，簡稱信標適體。Aptamer實現了“信號探針”的轉化，并運用MBA實現了重組E1E2蛋白、E2蛋白nM級的檢測以及被病毒感染的細胞上清中包膜蛋白的檢測。 信標適體（MBA）有望成為HCV包膜蛋白在病毒生活周期機制研究的新的重要手段和橋梁，為HCV的早期檢測提供一種新思路新方法，MBA有望成為一種新型的HCV早期檢測試劑，發(fā)展成為HCV早期診斷的新方法。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒 包膜蛋白 SELEX 核酸適體 分子信標核酸適體 熒光檢測 早期診斷
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-22
• 1.1 丙型肝炎病毒研究概況10-14
• 1.1.1 丙型肝炎病毒基因組10-11
• 1.1.2 丙型肝炎病毒粒子結構11
• 1.1.3 丙型肝炎病毒生活周期11-12
• 1.1.4 丙型肝炎病毒蛋白的結構和功能12-13
• 1.1.5 HCV 包膜蛋白 E1、E2 的功能介紹13
• 1.1.6 丙型肝炎的傳播途徑13-14
• 1.1.7 丙型肝炎的流行病學14
• 1.2 丙型肝炎的診斷與治療14-17
• 1.2.1 丙型肝炎的臨床診斷和實驗室診斷方法14-15
• 1.2.2 丙型肝炎的臨床治療15-17
• 1.3 核酸適體及其應用17-21
• 1.3.1 核酸適體17-18
• 1.3.2 核酸適體探針的篩選—SELEX 技術18-19
• 1.3.3 核酸適體在生物醫(yī)學中的應用19-20
• 1.3.4 分子信標核酸適體—核酸適體技術與分子信標原理的結合20-21
• 1.4 本課題的研究方案及目的21-22
• 第2章 丙型肝炎包膜蛋白 E1E2、E1、E2 的原核表達22-44
• 2.1 前言22-23
• 2.2 實驗材料、試劑與儀器23-25
• 2.2.1 質粒及菌種23
• 2.2.2 實驗試劑23-25
• 2.2.3 主要儀器和設備25
• 2.3 實驗步驟25-35
• 2.3.1 重組質粒 pET28b- E1E2、pET32a-E1、pET32a-E2 的構建25-30
• 2.3.2 E1E2、E1、E2 蛋白的小量誘導表達與鑒定30-31
• 2.3.3 HCV E1E2、HCV E1、HCV E2 蛋白的大量表達和純化31-35
• 2.4 實驗結果與討論35-43
• 2.4.1 重組質粒的構建及鑒定35-40
• 2.4.2 蛋白的表達及鑒定40-43
• 2.5 本章小結43-44
• 第3章 特異性識別 HCV 包膜蛋白 E1E2 的核酸適體的篩選與鑒定44-56
• 3.1 前言44-45
• 3.2 實驗材料與方法45-51
• 3.2.1 實驗材料及儀器設備45-46
• 3.2.2 實驗方法46-51
• 3.3 實驗結果與討論51-54
• 3.3.1 HCV E1E2 蛋白核酸適體的篩選51-53
• 3.3.2 特異性識別 HCV 包膜蛋白的核酸適體特異性鑒定53-54
• 3.4 本章小結54-56
• 第4章 基于信標適體對 HCV 包膜蛋白的特異性識別研究56-65
• 4.1 前言56-57
• 4.2 實驗材料與儀器57-58
• 4.2.1 實驗材料57-58
• 4.2.2 實驗儀器58
• 4.3 實驗方法58-60
• 4.3.1 MBAs 對重組 HCV 包膜蛋白檢測的可行性分析58
• 4.3.2 MBA3 特異性識別原核表達的 HCV 包膜蛋白58-59
• 4.3.3 MBA3 檢測被 HCVcc 感染的 Huh7.5 cells 上清的檢測59-60
• 4.4 實驗結果與討論60-64
• 4.4.1 MBAs 檢測重組 HCV 包膜蛋白的可行性分析結果60
• 4.4.2 實驗條件優(yōu)化結果60-62
• 4.4.3 MBA3 檢測原核表達的重組包膜蛋白62
• 4.4.4 MBA3 檢測包膜蛋白 E2 的檢出限以及標準曲線的繪制62-63
• 4.4.5 MBA3 檢測被 HCVcc 感染的細胞上清中包膜蛋白63-64
• 4.5 本章小結64-65
• 結論與展望65-66
• 參考文獻66-73
• 附錄 A 攻讀學位期間參與項目與發(fā)表論文73-74
• 附錄 B 常用自配試劑的配制方法74-76
• 附錄 C 非變性法純化蛋白所用試劑76-77
• 致謝77

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前6條

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  本文關鍵詞：靶向HCV包膜蛋白的信標適體應用于病毒檢測的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：378946