發(fā)布時(shí)間：2023-04-09 15:03

　　2009年3月18日在墨西哥首先出現(xiàn)甲型H1Nl流感,并發(fā)現(xiàn)病毒在人與人之間進(jìn)行傳播和蔓延,很快在國際上造成爆發(fā)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織疫情通報(bào),截止2010年3月7日,甲型H1Nl流感導(dǎo)致全球至少16713人死亡。此次病原體為發(fā)生基因重排的、同時(shí)含禽、豬、人、流感病毒核酸序列的新型H1N1流感病毒。甲型H1N1基因組為8節(jié)段負(fù)鏈RNA,共編碼10種與病毒功能和結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì),其中血凝素(Hemagglutinin,HA)是流感病毒囊膜纖突的主要成分之一,也是流感病毒的主要表面糖蛋白,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。因此,血凝素HA在流感的預(yù)防控制與診斷中有著重要的作用。 本研究從NCBI上獲得2009年4月來自美國不同州的14個(gè)H1N1-HA核酸序列,經(jīng)核酸序列比對分析,得到共有序列。按照人類密碼子使用頻率表對共有序列進(jìn)行優(yōu)化并全基因合成。把優(yōu)化后的基因插入到真核表達(dá)載體pSNAV中,構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pSNAV-Mod.HA與pSNAV-Mod.HA1;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后,獲得細(xì)胞單克隆,用免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測其表達(dá),結(jié)果顯示兩者皆可在BHK細(xì)胞...

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要 ABSTRACT 第一章 甲型H1N1 流感病毒研究進(jìn)展
1.1 甲型H1N1 流感的病原學(xué)特征
    1.1.1 甲型H1N1 流感病毒的形態(tài)與結(jié)構(gòu)
    1.1.2 甲型H1N1 流感病毒基因及其產(chǎn)物
    1.1.3 甲型H1N1 流感病毒的流行病學(xué)
    1.1.4 流感的流行情況回顧
    1.1.5 血凝素(Hemagglutinin，HA)與甲型流感病毒致病性的關(guān)系
    1.1.6 本試驗(yàn)研究的目的和意義 第二章 甲型H1N1 流感病毒血凝素基因HA 和HA1 真核載體的構(gòu)建及其蛋白初步表達(dá)
2.1 材料
    2.1.1 核酸序列、質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株
    2.1.2 工具酶、試劑和儀器
2.2 方法
    2.2.1 H1N1-HA 全基因序列的獲得與氨基酸序列分析
    2.2.2 HA 基因的密碼子優(yōu)化
    2.2.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及制備
    2.2.4 BHK 細(xì)胞培養(yǎng)
    2.2.5 G418 最佳濃度的確定
    2.2.6 FuGENE?HD 介導(dǎo)的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和單克隆的篩選及培養(yǎng)
    2.2.7 間接免疫熒光檢測HA 與HA1 基因在BHK 細(xì)胞的表達(dá)
    2.2.8 Western blot 檢測Mod.HA 和Mod.HA1 在BHK 細(xì)胞中的表達(dá)
2.3 結(jié)果與分析
    2.3.1 14 個(gè)最新H1N1-HA 氨基酸序列的同源性比較
    2.3.2 真核表達(dá)載體的酶切鑒定
    2.3.3 真核表達(dá)質(zhì)粒序列測定
    2.3.4 穩(wěn)定表達(dá)H1N1-HA 與H1N1-HA1 細(xì)胞系的建立
    2.3.5 間接免疫熒光與Western blot 檢測
2.4 討論
2.5 小結(jié) 第三章 甲型H1N1 流感病毒血凝素基因 HA1 的腺病毒包裝
3.1 材料
    3.1.1 腺病毒包裝系統(tǒng)和細(xì)胞
    3.1.2 核酸序列及質(zhì)粒和菌株
    3.1.3 工具酶、試劑和儀器
    3.1.4 H1N1-HA1 基因序列的獲得與氨基酸序列分析
    3.1.5 HA1 基因的密碼子優(yōu)化
3.2 方法
    3.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建和腺病毒包裝
    3.2.2 重組腺病毒的傳代和大量擴(kuò)增
    3.2.3 重組腺病毒的鑒定
3.3 結(jié)果
    3.3.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pDC315- Mod.HA1 的酶切鑒定
    3.3.2 真核表達(dá)質(zhì)粒pDC315- Mod. HA1 序列測定
    3.3.3 重組腺病毒在293 細(xì)胞中的典型病變
    3.3.4 重組腺病毒的鑒定結(jié)果
3.4 討論
3.5 小結(jié) 結(jié)論 參考文獻(xiàn) 致謝 作者簡介



本文編號(hào)：3787228